粘附型细胞的培养方法、培养容器和蛋白质的产生方法技术

本发明专利技术是即使让粘附型细胞处于悬浮状态下，也能够不使其死亡而是使其增殖的粘附型细胞的培养方法；包含液体培养基和在该液体培养基中悬浮生存的粘附型细胞、使用含脂环结构的聚合物而制成的培养容器；以及蛋白质的产生方法。通过使粘附型细胞和含脂环结构的聚合物成型体接触，从而能够使该粘附型细胞在液体培养基中以悬浮的状态增殖。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及即使让细胞处于悬浮状态下也能够不使其死亡而是使其增殖的粘附型细胞的培养方法、包含液体培养基和在该液体培养基中悬浮生存的粘附型细胞的使用含脂环结构的聚合物而制成的培养容器、以及蛋白质的产生方法。
技术介绍
在创新药研究、以万能细胞、干细胞为对象的研究中，目前进行的是通过基因重组法而使目标的蛋白质产生。作为例如重组医药品，已知有用于癌症治疗、风湿病治疗的抗体、作为用于增加红细胞的荷尔蒙的促红细胞生成素(EPO)等以蛋白质为成分的重组医药品。这些重组医药品被认为引起预期以外的副作用的风险比利用现有技术的化学合成而合成的医药品小，因此备受关注。然而，重组医药品有用于治疗的给药量多、并且用于生产的费用高的情况，没有达到充分的普及。因此，提高生产率成为了课题。重组医药品例如可通过在CHO细胞等粘附型细胞中，导入目标的蛋白质的基因，使其在无血清培养基中驯化，在变得以悬浮状态增殖的重组CHO细胞内使目标的蛋白质生物合成而生产。为了提高重组医药品的生产率，可考虑优选以细胞的密度高的状态来培养细胞。作为使目标的蛋白质的生产率提高的方法，已知有利用微载体(microcarrier)的方法(非专利文献1)。在该方法中，使CHO细胞粘附于微载体，使其分散在培养液中。因此，能够以不使CHO细胞处于悬浮状态的方式在培养液中搅拌培养。然而，在该方法中，有微载体价格高的问题、因为细胞仅存在于微载体的表面所以难以充分提高培养液中的细胞密度的问题。此外，作为使作为粘附型细胞的CHO细胞悬浮而培养的方法，例如，在专利文献1中记载有以下的方法：将具有对目标的蛋白质进行编码的基因和二氢叶酸还原酶基因的质粒基因导入到CHO细胞中，将得到的重组CHO细胞在比通常的细胞密度更低的条件下反复培养，由此在悬浮状态下培养重组CHO细胞。然而，该方法因为将CHO细胞反复培养直至成为悬浮状态，所以至该状态需要8周左右的长的时间。此外，当传代培养时间变长时，就会使得管理、确认基因的变异、细胞的变质等状态的精力和费用增加。此外，专利文献2中记载有以下的方法：将人抗凝血酶基因和二氢叶酸还原酶基因编入二氢叶酸还原酶基因缺失型细胞株中，将悬浮状态的重组CHO细胞使用中空纤维型培养装置进行培养，从而使该细胞一边悬浮一边制造人抗凝血酶。然而，在该方法中，安装了中空纤维的装置复杂且价格昂贵，因此存在费用方面的问题。此外，当为了大量培养而使中空纤维尺寸变大时，在中空纤维的两端的培养基交换不均等，培养基容易变得不均匀。结果是，培养基的pH等发生变化，给中空纤维内的细胞附加了压力，因此有目标的蛋白质的生产率下降的风险。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开平2-009388号公报；专利文献2：日本特开2005-073509号公报。非专利文献非专利文献1：http：//www.gelifesciences.co.jp/catalog/0830.html。
技术实现思路
专利技术要解决的课题如上所述，虽然以前也提出了一些在高密度的条件下培养粘附型细胞的技术方案，但现状是期望可效率更好且更廉价地培养粘附型细胞的方法。本专利技术是鉴于这样的实际情况而完成的，其课题在于提供：不需要特殊操作，即使让粘附型细胞处于悬浮状态下，也能够不使其死亡而是使其增殖的培养方法；含有液体培养基和在该液体培养基中悬浮生存的粘附型细胞、使用含脂环结构的聚合物而制成的培养容器；以及利用了上述粘附型细胞的培养方法的蛋白质的产生方法。用于解决课题的方案本专利技术人为了解决上述课题，进行了深入的研究，结果发现，通过使含脂环结构的聚合物成型体与培养细胞接触，从而能够使得需要作为支持物的细胞外基质的粘附型细胞在液体培养基中以悬浮状态生存且增殖，从而完成了本专利技术。像这样，根据本专利技术，可提供下述(1)～(5)的粘附型细胞的培养方法、(6)、(7)的培养容器以及(8)的蛋白质的产生方法。(1)一种粘附型细胞的培养方法，其特征在于，通过使粘附型细胞和含脂环结构的聚合物成型体接触，从而使该粘附型细胞在液体培养基中以悬浮的状态增殖。(2)根据(1)所述的粘附型细胞的培养方法，其中，上述粘附型细胞是表达外源基因的经基因重组的粘附型细胞。(3)根据(1)或(2)所述的粘附型细胞的培养方法，其中，上述粘附型细胞是CHO细胞。(4)根据(1)或(2)所述的粘附型细胞的培养方法，其中，上述粘附型细胞是能够表达外源基因的细胞。(5)根据(1)～(4)中任一项所述的粘附型细胞的培养方法，其中，上述悬浮状态的粘附型细胞是形成了细胞块的粘附型细胞。(6)一种培养容器，包含液体培养基和在该液体培养基中悬浮生存的粘附型细胞，是使用含脂环结构的聚合物而制成的。(7)根据(6)所述的培养容器，其中，上述粘附型细胞是形成了细胞块的粘附型细胞。(8)一种生物活性蛋白质的产生方法，其特征在于，在能够表达对该蛋白质进行编码的外源基因的重组细胞的培养中，使该细胞和含脂环结构的聚合物成型体接触。专利技术效果根据本专利技术，可提供：不需要特殊操作，即使让粘附型细胞处于悬浮状态下，也能够不使其死亡而是使其增殖的粘附型细胞的培养方法；包含液体培养基和在该液体培养基中悬浮生存的粘附型细胞、使用含脂环结构的聚合物而制成的培养容器；以及利用了上述粘附型细胞的培养方法的蛋白质的产生方法。附图说明图1是示出培养重组CHO细胞时的经过日数的活细胞数的图表。图2是示出培养重组CHO细胞17日时的培养基中的EPO的浓度的图表。图3是示出培养重组CHO细胞时的培养基中的EPO的浓度和反映细胞内的成分的泄露的LDH活性测定值的关系的图表。具体实施方式本专利技术的方法是粘附型细胞的培养方法，其特征在于，通过使粘附型细胞和含脂环结构的聚合物成型体接触，从而使该粘附型细胞在液体培养基中以悬浮的状态增殖。本专利技术中使用的粘附型细胞没有特别限定，可以根据目的任意选择。在本专利技术中，粘附型细胞可以是指粘附型细胞本身，也可以是指来自粘附型细胞的细胞。所谓粘附型细胞本身指的是在通常的培养条件下，通过粘附于细胞外基质而能够生存和增殖的细胞，因此也被称为支持物依赖性细胞。所谓来自粘附型细胞的细胞指的是通过对粘附型细胞给予一些外部因素而使其成为即使不粘附于细胞外基质也能够生存且增殖的细胞，例如驯化培养粘附型细胞使其成为即使在悬浮状态下也能够生存、增殖的细胞等。作为粘附型细胞，可列举出以CHO细胞、VERO细胞、NIH3T3细胞、HEK293细胞等为代表的基因操作的宿主细胞、有病毒敏感性的细胞，其中，优选CHO细胞。此外，粘附型细胞优选为表达外源基因的经基因重组的粘附型细胞。作为这样的细胞，可列举出通过使用噬菌体、质粒的载体(vector)等的转导等而能够表达外源基因的细胞。在此，外源基因能够根据目的任意选择。具体而言，可列举出对促红细胞生成素(以下，称为EPO)、干扰素(α、β、γ)、粒细胞集落刺激因子G-CSF、白介素、粒细胞巨噬细胞·集落刺激因子GM-CSF、人生长荷尔蒙、胰岛素、胰高血糖素、血液凝固第VIII因子、人类抗体等细胞因子、荷尔蒙这样的生物活性蛋白质进行编码的基因。当在这样的重组细胞的培养中使其接触含脂环结构的聚合物成型体时，生物活性蛋白质的生产量增大。在本专利技术中，对细胞进行培养时，可使液体培养基。作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粘附型细胞的培养方法，其特征在于，通过使粘附型细胞和含脂环结构的聚合物成型体接触，从而使该粘附型细胞在液体培养基中以悬浮的状态增殖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.26 JP 2014-1309441.一种粘附型细胞的培养方法，其特征在于，通过使粘附型细胞和含脂环结构的聚合物成型体接触，从而使该粘附型细胞在液体培养基中以悬浮的状态增殖。2.根据权利要求1所述的粘附型细胞的培养方法，其中，所述粘附型细胞是表达外源基因的经基因重组的粘附型细胞。3.根据权利要求1或2所述的粘附型细胞的培养方法，其中，所述粘附型细胞是CHO细胞。4.根据权利要求1或2所述的粘附型细胞的培养方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：市村直也，平野孝明，
申请(专利权)人：日本瑞翁株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP