本发明专利技术涉及用于检测嗜铬粒蛋白A(或其片段)的免疫测定方法，其包括以下步骤：将怀疑包含嗜铬粒蛋白A的样品与对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，以及对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，在允许嗜铬粒蛋白A与所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合体的条件下接触，并检测所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物与嗜铬粒蛋白A的结合。还提供了针对嗜铬粒蛋白A的124位至144位氨基酸残基和280位至301位氨基酸残基的抗体及其在所述免疫测定方法中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
嗜铬粒蛋白A(ChromograninA，CgA)为1965年从牛肾上腺髓质的嗜铬细胞中鉴定并分离的蛋白质(Banks等1965.BiochemJ97：40C-1C；Taupenot等2010.NewEngJMed.348：1134-49)。嗜铬细胞为主要发现于哺乳动物肾上腺髓质中的神经内分泌细胞。嗜铬粒蛋白A是已建立的多种神经内分泌肿瘤的肿瘤标志物，来自于神经内分泌细胞的罕见瘤的异质组包括多发性内分泌瘤形成1型和2型(MEN1/MEN2)、髓样甲状腺癌、类癌肿瘤、胰岛细胞肿瘤、嗜铬细胞瘤/副神经节瘤、低分化/小细胞/非典型肺类癌、肺小细胞癌、Merkel细胞癌(Deftos等1991.Endocr.Rev.12：181-7；Corti等1996.BrJCancer73：924-32)并且在若干指南中被提及(Ramage等2012.Gut61：6-32；Vinik等2010.NANETSPancreas39(6)：713-734；Pape等2012.ENETS95：135-156)。人嗜铬粒蛋白A具有439个氨基酸残基的序列(参见SEQIDNO：1)，构成49kDa的酸性糖蛋白，其在内分泌细胞、神经元和神经内分泌细胞的嗜铬颗粒中储存，并且与它们各自的激素、神经递质和神经肽一起从其中释放(Kim等2001.Cell106：499-509)。嗜铬粒蛋白A是嗜铬粒蛋白/分泌粒蛋白家族的主要成员，其由一组来源于不同基因但共享许多特征的蛋白质组成，所述特征即大量的酸性氨基酸残基和很多成对的碱性氨基酸作为用于翻译后加工(Metz-Boutigue等1993.Eur.J.Biochem217：247-257)和切割的潜在位置。CgA是若干生物活性肽片段的前体，其已被描述于人和其他物种中：血管形成抑制素(Drees等1991.Endocrinology129：3381-7)、嗜铬粒抑制蛋白(Galindo等1991.ProcNatlAcadSciUSA88：1426-30)、chromacin(Strub等1997.JBiolChem272：11928-36)、胰抑制素(Tatemoto等1986.Nature324：476-8)、WE-14(Curry等1992.FEBSLett301：319-321)、儿荼酚抑素(catestatin)(Mahata等1997.JClinInvest100：1623-33)、旁腺抑制素(Fasciotto等1993.Endocrinology133：461-6)和GE-25(Kirchmair等1995.BiochemJ310(Pt1)：331-6)。在UniProt数据库中，提到了额外的人嗜铬粒蛋白A的肽(登录号：P10645)，基于切割位点，其可预测待释放的肽：血管形成抑制素-1包含氨基酸序列1-76，血管形成抑制素-2包含氨基酸序列1-113，EA-92包含氨基酸序列116-207，ES-43包含氨基酸序列210-242，胰抑制素包含氨基酸序列254-301，SS-18包含氨基酸序列304-321，WE-14包含氨基酸序列324-337，WA-8包含氨基酸序列324-331，LF-19包含氨基酸序列340-358，AL-11包含氨基酸序列362-372，GV-19包含氨基酸序列375-393，GR-44包含氨基酸序列395-438并且ER-37包含氨基酸序列402-438。此外，已示出不同的神经内分泌细胞可区别地加工分子(Portela-Gomes等2001.JHistochemCytochem4：483-90)。嗜铬粒蛋白A被描述为许多疾病和病症的生物标志物，所述疾病和病症包括癌症，例如前列腺癌(WO2013/070088A1；WO2013/070089A1；US6,238,877B1；WO2012/065025A2)。目前，4种用于检测嗜铬粒蛋白A的非放射性CE-标记的市售测定是可用的：Cis-BioELISA测定(CisbioBioassays，Codolet，France)使用2个单克隆抗体，其针对对应于145位至197位氨基酸和219位至234位氨基酸的表位；DAKOELISA测定(DakoDenmarkA/S，Glostrup，Denmark)使用兔多克隆抗体，其针对23kDa的C端片段；Euro-DiagnosticaNEOLISATM夹心ELISA测定(EuroDiagnosticaAB，Sweden)使用2个单克隆抗体，其针对对应于236位至251位氨基酸和264位至279位氨基酸的表位(也参见WO2011/135035A1和WO99/58980A1)。用于检测嗜铬粒蛋白A的仅有的可用的全自动化测定为嗜铬粒蛋白AKRYPTOR测定(ThermoFisherScientificB.R.A.H.M.SGmbH，Hennigsdorf，Germany)，其使用2个单克隆抗体，一个单克隆抗体结合对应于250位至301位氨基酸的表位(Popovici等2014.ClinBiochem47：87-91)。由于分子的高蛋白质水解作用，这些测定中所测量的浓度可根据所收集样品的储存随时间并且根据在该测定中通过抗体测量的片段而变化，因此对于嗜铬粒蛋白A的改善的测定应着眼于分子最稳定的片段并依据在不同储存条件下的样品稳定性进行评估。不同的公开描述了抗体表位和测定设计对嗜铬粒蛋白A免疫测定之临床性能的影响(Corti等1996.EurJ.Biochem235：275-280，Stridsberg等2003.JEndocrinol177：337-41)。
技术实现思路
本专利技术涉及用于检测嗜铬粒蛋白A或其片段的新测定设计。该测定使用一种或更多种与表位结合的抗体，其之前表征为结合不良或不结合的抗原位点(Corti等1996.EurJ.Biochem235：275-280)。本专利技术的测定出人意料地示出相比于现有的全自动化嗜铬粒蛋白AKRYPTOR测定(B.R.A.H.M.SGmbH，Hennigsdorf，Germany)，在样品中提高的分析物稳定性。本文所提供的免疫测定还具有广泛的检测范围，即对靶蛋白的检测在至少约9ng/ml至约3mg/ml的浓度范围内是可能的。因为需要稀释更少的样品，所以广泛的检测范围导致了经济的优势。因此，本专利技术的测定可例如用作研究工具，并且在临床应用中用于在广泛的浓度范围中以高特异性进行嗜铬粒蛋白A的检测。在临床应用的情况下，本专利技术的测定可用于检测患者样品中的嗜铬粒蛋白A，以用于病症或医学状况的诊断、预后、风险评估、风险分级、治疗控制和/或术后控制。特别地，本专利技术提供了用于检测嗜铬粒蛋白A或其片段的免疫测定方法，其包括以下步骤：a)将怀疑包含嗜铬粒蛋白A的样品与对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，以及对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，在允许嗜铬粒蛋白A与所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合体(ternarycomplex)的条件下接触，并且b)检测所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物与嗜铬粒蛋白A的结合。在根据本专利技术的免疫测定方法中，所述第一抗体可对嗜铬本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测嗜铬粒蛋白A或其片段的免疫测定方法，其包括以下步骤：a)将怀疑包含嗜铬粒蛋白A的样品与(i)对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中所述第一抗体或其抗原结合片段或衍生物对包含于跨越根据SEQ ID NO：1之124位至144位氨基酸残基的序列中的表位具有特异性，以及(ii)对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，在允许嗜铬粒蛋白A与所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合体的条件下接触，并且b)检测所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物与嗜铬粒蛋白A的结合。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.15 EP 14164809.71.用于检测嗜铬粒蛋白A或其片段的免疫测定方法，其包括以下步骤：a)将怀疑包含嗜铬粒蛋白A的样品与(i)对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中所述第一抗体或其抗原结合片段或衍生物对包含于跨越根据SEQIDNO：1之124位至144位氨基酸残基的序列中的表位具有特异性，以及(ii)对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，在允许嗜铬粒蛋白A与所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合体的条件下接触，并且b)检测所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物与嗜铬粒蛋白A的结合。2.根据权利要求1所述的免疫测定方法，其中所述第二抗体或其抗原结合片段或衍生物对包含于跨越根据SEQIDNO：1之280位至301位氨基酸残基的序列中的表位具有特异性。3.根据权利要求1或2所述的免疫测定方法，其中所述第一抗体由保藏为DSMACC3231的杂交瘤细胞系537/H2产生。4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫测定方法，其中所述第二抗体由保藏为DSMACC3232的杂交瘤细胞系541/E2产生。5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫测定方法，其中所述样品来源于对象的体液或组织，例如选自血液、血清、血浆和尿的体液。6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫测定方法，其中所述测定在均相中或异质相中进行。7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫测定方法，其中所述抗体之一被标记且另一抗体结合于固相或能够选择性地结合于固相。8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫测定方法，其中所述第一抗体和所述第二抗体分散地存在于液体反应混合物中，并且其中作为基于荧光或者化学发光熄灭或...
【专利技术属性】
技术研发人员：帕斯卡利娜·卡吕埃尔，瓦莱丽·里戈，纳迪娜·介朗，
申请(专利权)人：塞尚公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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