自我复制RNA分子的病毒样递送颗粒制造技术

通过用包裹在小颗粒中的自我复制型RNA进行给药达到核酸免疫目标。所述RNA编码感兴趣的免疫原，而颗粒可以通过模拟天然RNA病毒的递送功能来递送该RNA。因此本发明专利技术提供了在体内向脊椎动物细胞递送RNA的非病毒颗粒，其中所述颗粒由递送材料包裹着编码免疫原的自我复制RNA分子构成。这些颗粒是药物组合物的有用成分，用于针对各种疾病免疫对象。

【技术实现步骤摘要】
本申请请求受益于美国专利临时申请61/361,828(2010年7月6日提交)，其完整内容通过引用纳入本文用作所有目的。
本专利技术所属领域是用于免疫目的的自我复制RNA的非病毒递送。
技术介绍
通过递送核酸对动物实现免疫是多年来的目标。曾经试验了各种途径，包括应用DNA或RNA、病毒或非病毒递送载体(或者甚至不用递送载体的“裸”疫苗)、复制型或非复制型载体，或者是病毒或非病毒载体。现对于进一步且改进的核酸疫苗仍存在需求，特别是核酸疫苗的改良递送方式。专利技术详述根据本专利技术，核酸免疫是通过将自我复制型RNA包封于和/或吸附于一种小颗粒进行传输来实现的。所述RNA编码感兴趣的免疫原，所述颗粒则模拟天然病毒的传输功能来递送该RNA。因而本专利技术提供了在体内向脊椎动物细胞递送RNA的非病毒颗粒，其中的颗粒由递送材料包裹着编码免疫原的自我复制RNA分子构成。本专利技术还提供在体内向脊椎动物细胞递送RNA的非病毒颗粒，其中的颗粒由递送材料上吸附有编码免疫原的自我复制RNA分子组成。这些颗粒在针对各种疾病对动物个体实施免疫的药物组合物中是有用的组成部分。结合运用一种非病毒颗粒来递送自我复制型RNA，提供了在仅递送少量RNA的情况下就能诱导出针对免疫原的强效和特异性的免疫应答的一种方法。此外，这些颗粒容易实现商业规模的制造。颗粒本专利技术中的颗粒是非病毒颗粒，即它们不是病毒。因而颗粒不含有衣壳蛋白。因规避了制备衣壳颗粒的需要，本专利技术无需细胞包装流程，故使得商业化生产放大变得容易，且最大程度减少了不经意间产生危险的感染性病毒的风险。本专利技术的颗粒由递送材料构成，而不是将RNA包裹在病毒粒子中。多种材料适合于生产可在体内向脊椎动物细胞递送RNA的颗粒。特别令人感兴趣的两种递送材料是：(i)可形成脂质体的两亲性脂肪，以及(ii)可形成微粒的无毒且可生物降解的高分子聚合物。通过脂质体传输时，必须将RNA包裹于其中；如通过多聚物微粒传输，RNA可以是包封或吸附的形式。第三种感兴趣的递送材料是多聚物、交联剂、RNA以及带电荷的单体的微粒反应产物。本专利技术一个实施方式中的颗粒包含了包封编码免疫原的自我复制RNA分子的脂质体，另一个实施方式中包含了包封编码免疫原的自我复制RNA分子的多聚物微粒，还有一个实施方式中包含了吸附编码免疫原的自我复制RNA分子的多聚物微粒。在所有三种情况下颗粒都基本上以球形为宜。第四个实施方式中本专利技术的颗粒包含了多聚物、交联剂、编码免疫原的自我复制RNA分子以及带电荷的单体的微粒反应产物。这些颗粒在模具中成型因而可制作成任何形状，其中包括但不仅限于球形。RNA可以被包封在颗粒中(尤其是当颗粒是脂质体时)。这意味着颗粒内的RNA(如同在天然病毒内的那样)被递送材料隔离于外界基质，发现包封体可以保护RNA免于RNA酶降解。可以采取各种形式进行包封。例如在某些实施方式中(如像在单层脂质体中)递送材料围绕含有RNA的水性内核外形成外层，在另一些实施方式中(如模具成型颗粒)递送材料形成内含RNA的基质。所述颗粒可包括一些外在的RNA(例如，在颗粒外表面)，但至少一半的RNA(最理想是全部)被包封在内部。包封于脂质体内部明显区别于参考资料1中披露的脂质/RNA复合物。RNA可以吸附于颗粒上(尤其是当颗粒是一种多聚物微粒时)。这意味着递送材料未将RNA与外界基质相隔离，不像病毒中的RNA基因组那样。颗粒可以包括一些被包封的RNA(如，包封在颗粒核心内)，但至少一半的RNA(最理想是全部)被吸附。脂质体各种两亲性脂肪可在水性环境内形成双层以包裹含有RNA的水性内核，成为脂质体。这些脂肪可具有阴性的、阳性的或两性离子的疏水性末端基团。由阴性磷脂生成脂质体可追朔到十九世纪六十年代，生成阳性脂质体的脂类则自从十九世纪九十年代一直在研究。一些磷脂是阴离子的，其他有两性的，还有阳离子的。适合的磷脂类型包括，但不仅限于：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油，一些有用的磷脂类列于表1。有用的阳性脂类包括，但不仅限于：二油酰氧基三甲胺丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。两性离子脂质类包括，但不仅限于：两性脂肪酰和两性脂肪醚。有用的两性脂类的例子有DPPC、DOPC和十二基磷基胆碱。脂质类可以是饱和的或不饱和的。以运用至少一种不饱和脂制备脂质体为宜。如果一种不饱和脂有两个尾部，可以是两端均为不饱和，或是一个饱和另一个不饱和。本专利技术的脂质体颗粒可由单个的脂或混合的脂生成。混合脂可含有(i)阴离子脂质的混合物，(ii)阳离子脂质混合物，(iii)两性离子脂质混合物，(iv)阴离子脂质与阳离子脂质的混合物，(v)阴离子脂质与两性离子脂质的混合物，(vi)两性离子脂质与阳离子脂质的混合物，或(vii)阴离子脂质、阳离子脂质、两性离子脂质的混合物。类似地，一种混合物可同时含有饱和与非饱和脂。例如，混合物含有DSPC(两性离子，饱和)、DlinDMA(阳离子,不饱和)、和/或DMG(阴离子，饱和)。当采用混合脂时，并非所有脂质成分都需要是两亲性的，如：一种或多种两亲性脂可与胆固醇混合。脂质的疏水部分可PEG化(即：通过与聚乙二醇共价结合进行修饰)。这种修饰可增加稳定性并防止脂质体的非特异性吸附。例如，可运用参考文献2和3中所披露的技术将脂质与PEG结合。可用各种长度的PEG，如0.5-8kDa。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的混合物用于实施例。脂质体颗粒通常被分为三组：多层脂质体(MLV)、小单层脂质体(SUV)，以及大单层脂质体(LUV)。MLV的每个囊泡中有多个双层，形成多个独立的水性腔体。SUV和LUV具有包封水性内核的单个双层；SUV的典型直径是≤50nm，LUV直径>50nm。本专利技术脂质体颗粒的LUV理想直径在50-220nm范围。含有许多不同直径的LUV的组合物是：(i)至少80％数量的直径在20-220nm，(ii)群体的理想平均直径(Zav，按强度计)在40-200nm，和/或(iii)直径的多分散指数<0.2。参考资料1的脂质体/RNA复合体的直径可望在600-800nm，呈高分散性。制备合适的脂质体的技术为本领域所共知，如参见参考资料4-6。资料7描述了一种有用的方法，涉及到将以下要素混合：(i)脂质的乙醇溶液(ii)核酸的水溶液(iii)缓冲液，然后混匀、平衡、稀释和纯化。本专利技术中偏好的脂质体是通过此混合过程得到的。多聚微粒根据本专利技术各种高分子聚合物可形成微粒来包裹或吸附RNA。运用基本无毒的多聚物意味着受体可安全地接受其颗粒；运用可生物降解的多聚物意味着颗粒在完成递送后可以被代谢，避免长期滞留。有用的多聚物还要是可灭菌的，以便制成药用级配方。合适的无毒和可生物降解多聚物包括，但不仅限于：聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚内酯(包括聚己内酯)、聚二氧环己酮、聚戊内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸衍生的聚碳酸酯，或聚酯酰胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于向脊椎动物细胞体内递送RNA的非病毒颗粒，其中(a)所述颗粒含有一种递送材料，所述材料上吸附有编码免疫原的自我复制型RNA分子，和(b)所述RNA不含修饰的核苷酸。

【技术特征摘要】
2010.07.06 US 61/361,8281.一种用于向脊椎动物细胞体内递送RNA的非病毒颗粒，其中(a)所述颗粒含有一种递送材料，所述材料上吸附有编码免疫原的自我复制型RNA分子，和(b)所述RNA不含修饰的核苷酸。2.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒是无毒的、可生物降解的多聚微粒，其上吸附所述RNA。3.如权利要求2所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒包括聚(α-羟基酸)。4.如根据权利要求2或3所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒含有聚(D,L-乳酸-共-羟基乙酸)共聚物。5.如权利要求2或3所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒的直径为30nm-7μm。6.如权利要求2或3所述的颗粒，其特征在于，所述微粒的ζ电位为40-100mV。7.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒是可生物降解的交联寡聚纳米颗粒，它通过多聚物、交联剂、带电荷的单体和所述RNA的反应形成。8.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于，所述自我复制型RNA分子编码(...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·吉尔，C·曼德尔，D·欧哈根，M·辛格，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH