预防或治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的基于病毒样囊泡(VLV)的疫苗制造技术

本发明专利技术涉及用于治疗慢性乙型肝炎的治疗性免疫的组合物和方法的发现。本发明专利技术的方法包括生成进化的高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体的方法，治疗和/或预防HBV的方法，和诱导施用由此产生的VLV组合物的对象中抗HBV感染的记忆T和B细胞免疫应答的方法。而且，本发明专利技术包括用于给对象接种疫苗以保护对象免于HBV感染的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请在35U.S.C.§119(e)下要求2014年5月16日提交的美国临时申请号61/994,166的优先权，该申请在此通过引用以其全部并入本文。关于联邦政府赞助的研究或开发的声明本专利技术在由美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth)授予的拨款R37AI040357和R01AI45510下利用政府支持进行。政府享有本专利技术中的某些权利。
技术介绍
肝炎是指“肝脏的炎症”的一般术语并且具有主要来自病毒起源的许多起因。乙型肝炎是世界上最常见的严重的肝脏感染。其由通过血液和体液传播的乙型肝炎病毒(HBV)引起。感染可以通过在递送过程期间的如下方式发生：直接的血液与血液接触、无防护措施的性行为、受污染的针的使用、和从受感染的妇女到她的新生儿。HBV是属于肝DNA病毒科家族的嗜肝性(hepatotrophic)DNA病毒。病毒颗粒——病毒体，由外脂质包膜和由蛋白质构成的二十面体核衣壳芯组成。核衣壳包围病毒DNA和DNA聚合酶，该DNA聚合酶具有与逆转录病毒类似的逆转录酶活性(LocarniniS，2004.Semin.LiverDis.24(Suppl1)：3-10)。外包膜包含参与病毒结合和进入易感细胞的嵌入蛋白。病毒基因组的全长为大约3.2kb，并且其具有四个开放阅读框(ORF)，其包括表面抗原(“S基因”)、核心抗原(“C基因”)、DNA聚合酶(“P基因”)和被称为“X基因”的未确定功能的基因(Guo等，2009.HbpdInt8(1)：59-64)。用HBV感染可导致急性或慢性肝炎。一般而言，测试对乙型肝炎病毒阳性持续超过六个月的人被诊断为患有可能导致肝功能衰竭、肝癌或肝硬化的慢性感染(Wolfram，VirolJ.2013；10：239andDienstagJL.HepatitisBvirusinfection.NEnglJMed.2008；359：1486-1500)。形成慢性乙型肝炎病毒感染的风险与受病毒感染的人的年龄直接地相关。如果暴露于乙型肝炎病毒，婴儿和儿童受到慢性感染的风险最大。例如，90％的暴露的婴儿将形成慢性感染，30-50％的暴露的儿童将形成慢性感染，和10％的暴露的成年人将形成慢性感染。患有慢性HBV感染的人形成肝细胞癌的风险比未患有慢性HBV感染的人高多达300倍。在全球，HBV引起世界上60-80％的原发性肝癌。每年，全世界大约1百万人死于慢性活动性肝炎、肝硬化或HBV诱发的肝癌。因此，HBV在已知的人致癌物质中排第二，仅次于烟草(www.cdc.gov/hepatitis/HBV和www.mayoclinic.org/diseases-conditions/hepatitis-b/)。虽然针对HBV的疫苗已经被广泛地使用数十年，但是人群中的HBV流行率仍然居高不下。当前用于慢性HBV感染的疗法对病毒RNA和蛋白表达仅仅具有有限的抑制作用并且通常抑制但不消除病毒。例如，通常使用的核苷逆转录酶抑制剂恩替卡韦(Entecavir)或替诺福韦(Tenofovir)抑制慢性HBV患者中的HBV复制，但是如果疗法停止，效果是可逆的。而且，尽管对治疗性免疫用于治疗慢性HBV做出了承诺，但是当前的HBV疫苗对于治疗性接种免疫是无效的。虽然其引起预防感染的强中和抗体应答，但是当前疫苗不诱导在感染后消除病毒所需要的CD8+T细胞应答。在世界的地方性发展中地区，当前疫苗对于普遍的预防性接种疫苗也不是最佳的，这是因为其不防护所有个体，抗体应答随时间推移减弱，并且对于长效免疫必须多次给药。以单一剂量提供长期免疫的改进的预防性疫苗或治愈慢性HBV的有效治疗性疫苗将对预防HBV相关性慢性肝疾病具有实质影响。出于这些原因，在本领域中仍然对于用于预防性和治疗性用途二者的有效HBV疫苗存在需要。本专利技术解决了这种需要。
技术实现思路
本专利技术提供了包含含有启动子序列的DNA序列的高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体的组合物和使用方法，所述启动子序列可操作地连接至编码Semliki病毒(塞姆利基森林病毒)(SFV)非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列、可操作地连接至SFV次基因组RNA启动子、可操作地连接至编码HBV抗原或其片段的DNA、可操作地连接至编码2A肽的2ADNA，其又可操作地连接至编码VSVG蛋白的水泡性口炎病毒(VSV)GDNA。本专利技术的高效价HBV载体的SFV非结构蛋白核苷酸序列包括选自以下的突变中的至少两种：G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G和T-11978-C，并且本专利技术的载体缺乏编码SFV结构蛋白的核苷酸序列。而且，当载体在细胞培养物中增殖时，获得至少107噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。在另一方面，本专利技术提供了包含含有启动子序列的DNA序列的高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体的组合物和使用方法，所述启动子序列可操作地连接至编码甲病毒属非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列、可操作地连接至甲病毒属次基因组RNA启动子、可操作地连接至编码HBV抗原或其片段的DNA、可操作地连接至编码2A肽的2ADNA，其又可操作地连接至编码VSVG蛋白的水泡性口炎病毒(VSV)GDNA。本专利技术的高效价HBV载体的甲病毒属非结构蛋白核苷酸序列包括选自以下的突变中的至少两种：G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G和T-11978-C，并且本专利技术的载体缺乏编码甲病毒属结构蛋白的核苷酸序列。而且，当载体在细胞培养物中增殖时，获得至少107噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。本专利技术还包括针对HBV感染免疫对象的方法。该方法包括给对象施用包括由本专利技术的高效价HBV载体产生的至少107pfu/mlVLV的组合物，其中HBV抗原的表达诱导对象中的免疫应答。在另一方面，本专利技术提供了治疗和/或预防对象中的疾病的方法。该方法包括给需要这类治疗的对象施用治疗上有效量的由本专利技术的高效价HBV载体产生的组合物。本专利技术还提供了给对象接种疫苗的方法，该方法包括给对象施用药学上可接受量的由本专利技术的高效价HBV载体产生的组合物，其中组合物的施用引起对象中的免疫应答。在进一步方面，本专利技术提供了在对象中对HBV抗原或其片段生成记忆T细胞免疫应答的方法。该方法包括如下步骤：以有效引起对象中免疫应答的量给对象施用由本专利技术的高效价HBV载体产生的组合物；和在第二随后时间段，施用第二有效量的本专利技术的组合物，其中针对HBV抗原或其片段的T记忆细胞在对象中生成。本专利技术进一步提供了在对象中对HBV抗原或其片段生成适应性B细胞免疫应答的方法。该方法包括如下步骤：以有效引起对象中免疫应答的量给本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体，其包括含有启动子序列的DNA序列，所述启动子序列可操作地连接至编码Semliki病毒(SFV)非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列、可操作地连接至SFV次基因组RNA启动子、可操作地连接至编码HBV抗原或其片段的DNA、可操作地连接至编码2A肽的2A DNA，其又可操作地连接至编码水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白的VSV G DNA，其中所述SFV非结构蛋白核苷酸序列包括选自以下的突变中的至少两种：G‑4700‑A、A‑5424‑G、G‑5434‑A、T‑5825‑C、T‑5930‑C、A‑6047‑G、G‑6783‑A、G‑6963‑A、G‑7834‑A、T‑8859‑A、T‑8864‑C、G‑9211‑A、A‑10427‑G、G‑11560‑A、A‑11871‑G和T‑11978‑C，其中所述载体缺乏编码SFV结构蛋白的核苷酸序列，进一步其中当所述载体在细胞培养物中增殖时，获得至少107噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.16 US 61/994,1661.一种高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体，其包括含有启动子序列的DNA序列，所述启动子序列可操作地连接至编码Semliki病毒(SFV)非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列、可操作地连接至SFV次基因组RNA启动子、可操作地连接至编码HBV抗原或其片段的DNA、可操作地连接至编码2A肽的2ADNA，其又可操作地连接至编码水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白的VSVGDNA，其中所述SFV非结构蛋白核苷酸序列包括选自以下的突变中的至少两种：G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G和T-11978-C，其中所述载体缺乏编码SFV结构蛋白的核苷酸序列，进一步其中当所述载体在细胞培养物中增殖时，获得至少107噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。2.权利要求1所述的高效价杂交HBV载体，其中所述启动子序列包括组成型启动子。3.权利要求2所述的高效价杂交HBV载体，其中所述所述启动子序列包括巨细胞病毒立即早期启动子。4.权利要求1所述的高效价杂交HBV载体，其中获得至少5x107pfu/ml的效价的VLV。5.权利要求4所述的高效价杂交HBV载体，其中获得至少1x108pfu/ml的效价的VLV。6.权利要求1所述的高效价杂交HBV载体，其中所述HBV抗原或其片段选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒蛋白X(HBx)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶和其任意组合。7.权利要求6所述的HBV抗原，其中所述乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎表面中蛋白(MHBs)。8.一种组合物，其包括由权利要求1所述的高效价杂交病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)。9.权利要求8所述的组合物，其中所述HBV抗原或其片段选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒蛋白X(HBx)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶和其任意组合。10.权利要求9所述的HBV抗原，其中所述乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎表面中蛋白(MHBs)。11.权利要求8所述的组合物，其中所述HBV抗原与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关联。12.一种针对HBV感染免疫对象的方法，所述方法包括给所述对象施用包含至少107pfu/ml的VLV的权利要求8所述的组合物，其中所述HBV抗原的表达诱导所述对象中的免疫应答。13.权利要求12所述的方法，其中所述HBV抗原或其片段选自乙型肝炎表面...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·罗贝克，J·罗斯，T·雷诺兹，
申请(专利权)人：耶鲁大学，
类型：发明
国别省市：美国;US