基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法技术

本发明专利技术涉及基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，包括如下步骤：将糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶溶解于酸性缓冲溶液中，配制成质量分数为10％～50％的溶液后，去除溶液中的氧气，然后依次向溶液中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基丁二酰亚胺，去除氧气后活化15分钟～45分钟；将多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到上述溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；向上述溶液中加入荧光染色试剂，避光反应25分钟～35分钟；将上述溶液冷冻干燥，以得到胰岛培养支架。本发明专利技术操作简便易行，反应条件温和，适于工业化或临床应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法。
技术介绍
1型糖尿病是一种自身免疫性疾病。该疾病由机体免疫系统功能障碍，导致胰岛β-细胞坏死，引起糖代谢功能障碍。尽管据InternationalDiabetesFederation(IDF)统计，1型糖尿病患者仅占总糖尿病患者的10％。但1型糖尿病发病较早，多发于儿童及青少年，因此患病时间较长，如血糖控制不当会引发包括心脏、肾脏、肝脏、神经及眼部等多重器官并发症，严重影响患者的生活质量并对社会及家庭造成巨大经济负担。目前，注射胰岛素是主要的治疗1型糖尿病的方法，该方法虽可以有效控制患者血糖，却无法根治1型糖尿病，也无法对患者代谢功能紊乱等做出更为精准的控制。另外，长期服用胰岛素也会造成体重增加，不利于进行血糖检测及对其他心血管并发症的调控。胰岛移植可被认为是治疗1型糖尿病手段中最具有潜力的治愈性治疗手段。自2000年Edmonton胰岛移植方法成功使7名糖尿病患者实现100％脱离对胰岛素的依赖后，胰岛移植这一手段成为有可能完全治愈1型糖尿病最具潜力的途径。但Edmontonprotocol主要通过直接向肝脏门静脉注射胰岛的方法进行胰岛移植，随后的临床结果表明，在接受治疗的糖尿病患者中，胰岛移植术后，超过90％的患者在5年内均病情复发，重新进行胰岛素治疗。导致病情复发的主要原因在于移植后的胰岛在患者体内，因胰岛移植位置、免疫反应等诸多原因无法及时完成血运重建，导致胰岛流失加速，从而加大胰岛移植手术在所需胰岛数量上的要求。而胰岛移植手术的另一个瓶颈恰恰是供体数量有限，因此造成恶性循环，使目前胰岛移植无法前行。因此如何完善胰岛移植手段，使胰岛能够更好的被纳入接受移植患者的循环系统，从而解决胰岛流失问题，是现阶段针对胰岛移植研究的重点方向。采用生物材料辅助胰岛移植的相关研究也在近年来被广泛关注。目前胰岛移植所采用的生物材料众多且各有优缺，可大体分为包裹型材料和半包裹型材料两大类。半包裹材料中的多孔支架类生物材料，能够为胰岛移植创造除传统移植点之外的新移植部位，但无法从根本解决接受胰岛移植患者免疫排斥等基本问题。包裹型材料包括水凝胶、微胶囊等，因为这类材料可以将胰岛完全包裹，因此能够解决移植手术后患者机体对移植胰岛的免疫排斥反应。但同时，也由于这类材料对胰岛的完全包裹，不利于毛细血管的形成，因此在胰岛移植后血运重建等方面有所欠缺。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提出一种反应条件温和，操作简便易行的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法。根据本专利技术的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，包括如下步骤：S101：将糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶溶解于酸性缓冲溶液中，配制成质量分数为30％～50％的溶液后，去除所述溶液中的氧气，然后依次向所述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，去除氧气后活化15分钟～45分钟，以得到活化后的溶液；S102：将多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；S103：向所述步骤S102处理过的溶液中加入荧光染色试剂，避光反应25分钟～35分钟；S104：将所述步骤S103处理过的溶液冷冻干燥，以得到胰岛培养支架；其中，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述N-羟基丁二酰亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)；所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)。根据本专利技术实施例的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，采用多臂聚乙二醇胺和/或多臂聚氧乙烯胺交联肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素以及透明质酸等糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶，糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶的生物相容性很好，多臂聚乙二醇、多臂聚氧乙烯胺以及糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶均为美国食品药品监督管理局(FDA)已经认证的医用材料，并且能比较全面的模拟胰岛细胞外基质微环境。利用糖胺聚糖静电作用力以及预先设下的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯残基，通过层层自组装的物理方法，成功将胰岛细胞团包裹在凝胶中，通过在凝胶本体连接小分子荧光基团，再次证明凝胶与胰岛的结合。本专利技术操作简便易行，反应条件温和，易于工业化，且化学/生物性状稳定，也适用于临床应用。另外，根据本专利技术上述实施例的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：优选地，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶为肝素；所述步骤S102为：将多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；其中，所述肝素与所述多臂聚乙二醇胺的质量比为(10:1)～(1:10)。优选地，所述多臂聚乙二醇胺为四臂聚乙二醇胺和/或八臂聚乙二醇胺。进一步地，所述肝素的相对分子质量为8000～14000，所述多臂聚乙二醇胺的相对分子质量为2000～20000。优选地，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶为硫酸软骨素；所述步骤S102为：将多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；其中，所述硫酸软骨素与所述多臂聚乙二醇的质量比为(10:1)～(1:10)。优选地，所述多臂聚乙二醇为四臂聚乙二醇胺和/或八臂聚乙二醇胺。进一步地，所述硫酸软骨素的相对分子质量为2000～20000，所述多臂聚乙二醇的相对分子质量为2000～20000。进一步地，所述酸性缓冲溶液的pH值为6.0～7.0。进一步地，所述酸性缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液。进一步地，所述荧光染色试剂为5-FAM-活化酯，且所述5-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺与所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶的物质的量之比为(1:900)～(1:1100)。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1是根据本专利技术的反应原理图以及反应组分的分子式；图2是经5-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯标记的多臂聚乙二醇和/或多臂聚氧乙烯胺交联肝素水凝胶包裹胰岛的组织切片显微图片；图3是经5-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯标记的多臂聚乙二醇和/或多臂聚氧乙烯胺交联肝素水凝胶包裹胰岛在体外培养过程中，使用倒置荧光显微镜观察到的图像；图4为胰岛经不同肝素浓度复合的水凝胶(肝素浓度分别为3mg/mL、7.5mg/mL、15mg/mL)在体外培养过程中的坏死及凋亡情况统计；图5表明包裹水凝胶的胰岛与胰腺内皮细胞共培养4小时、24小时、48小时后倒置荧光显微镜下的图片(图中亮点为CSFE荧光标记内皮细胞，白色虚线圈指示胰岛位置)；图6表明包裹水凝胶的胰岛相对于未包裹水凝胶的胰岛，高浓度葡萄糖刺激后胰岛素分泌能力对照图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S101：将糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶溶解于酸性缓冲溶液中，配制成质量分数为30％～50％的溶液后，去除所述溶液中的氧气，然后依次向所述溶液中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基丁二酰亚胺，去除氧气后活化15分钟～45分钟，以得到活化后的溶液；S102：将多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；S103：向所述步骤S102处理过的溶液中加入荧光染色试剂，避光反应25分钟～35分钟；S104：将所述步骤S103处理过的溶液冷冻干燥，以得到胰岛培养支架；其中，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述N‑羟基丁二酰亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)；所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)。

【技术特征摘要】
1.基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S101：将糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶溶解于酸性缓冲溶液中，配制成质量分数为30％～50％的溶液后，去除所述溶液中的氧气，然后依次向所述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，去除氧气后活化15分钟～45分钟，以得到活化后的溶液；S102：将多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；S103：向所述步骤S102处理过的溶液中加入荧光染色试剂，避光反应25分钟～35分钟；S104：将所述步骤S103处理过的溶液冷冻干燥，以得到胰岛培养支架；其中，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述N-羟基丁二酰亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)；所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)。2.根据权利要求1所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶为肝素；所述步骤S102为：将多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；其中，所述肝素与所述多臂聚乙二醇胺的质量比为(10:1)～(1:10)。3.根据权利要求2所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，所述多臂聚乙二醇胺为四臂聚乙二醇胺和/或八臂聚乙二醇胺。4.根据权利要求3所述的基于糖胺聚糖仿...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宸，娄少峰，张秀媛，孔德领，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12