撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体R194A制造技术

本发明专利技术涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及一种撒丁岛梭菌7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体R194A，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的7α‑羟基类固醇脱氢酶的第194位氨基酸由Arg变为Ala所得。该突变体对底物NADP

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体R194A。
技术介绍
羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroiddehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不严格”的底物特异性。例如，早在二十世纪八十年代初科学家就已经开始尝试利用微生物产生的7α-、7β-HSDH联合差向异构转化鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholicacid，CDCA)合成熊去氧胆酸(Ursodesoxycholicacid，UDCA)，转化的过程如图1所示。而游离酶还可以催化结合态胆汁酸——牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholicacid，TCDCA)转化为牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholicacid，TUDCA)。HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大应用潜力。然而，活性更高的HSDH改造体是其在生物转化领域进一步应用的基本保障。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-、7β-HSDH在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，GenBank中登记的功能已经确认的7α-HSDH共有5个，它们分别来自于Bacteroidesfragilis、Clostridiumscindens、Clostridiumsordellii、Clostridiumabsonum和Escherichiacoli；来自Clostridiumabsonum和Collinsellaaerofaciens的7β-HSDH基因也已经成功被克隆。上述双酶偶联构建的生物转化体系不但克服了辅酶循环难题，还实现了氧化、还原“一锅式”进行特定化学区域的羟基差向异构。酶的活性较低是限制其工业应用的主要因素之一，几乎所有的天然酶都需要经过改造后才能达到工业应用的要求。其中，撒丁岛梭菌7α-HSDH(Clostridiumabsonum7α-HSDH，CA7α-HSDH)具有悠久的研究历史和广阔的应用前景。加之该酶的晶体结构已经解析，所以通过理性改造的方式获得催化效率显著提高的突变体具有重要意义。
技术实现思路
为满足上述领域存在的需求，本专利技术提供一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，具有更高的催化效率，可用于多种底物的生物转化，在工业生产中有巨大的应用价值。本专利技术请求保护的技术方案如下：一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，是氨基酸序列为SEQIDNO：1的7α-羟基类固醇脱氢酶的第194位氨基酸由Arg变为Ala所得。编码上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。所述基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。一种表达盒，其特征在于，包含上述基因。一种载体，其特征在于，包含上述基因或表达盒。一种重组细胞，其特征在于，包含上述基因或表达盒或载体。一种制备上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的方法，其特征在于，在能够成功诱导蛋白表达的条件下培养上述重组细胞并分离得到撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。所述催化剂，其特征在于，还包括与上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体同时使用时能够提高酶催化效率或增加酶稳定性的其它试剂。一种实现化学物质的羰基不对称还原的方法，其特征在于，使用上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或任一上述催化剂与反应底物在15-37℃、pH6.0-11.0条件下进行催化反应。本专利技术首先从一级结构至高级结构多角度多层系比较了野生型CA7α-HSDH与同源酶蛋白的异同，确定了影响CA7α-HSDH酶学性质的位点为第194位氨基酸——精氨酸。然后通过密码子替换将精氨酸变为丙氨酸，并利用全基因合成技术获得了CA7α-HSDHR194A突变体的基因。最后通过构建突变体基因的GST融合表达载体并导入基因工程菌E.coliBL21中诱导表达，获得了CA7α-HSDHR194A突变体酶蛋白。通过测定不同底物浓度下的酶促反应初速度，利用米氏方程计算得到了CA7α-HSDH野生型和R194A突变体的酶促动力学参数。结果表明，R194A突变体对底物NADP+和TCDCA的催化效率是野生型的3.34倍。本专利技术的R194A突变体在生物转化CDCA/TCDCA获取UDCA/TUDCA的工业生产过程中具有巨大的应用潜力。本专利技术提供的载体，可以是克隆载体，包含CA7α-HSDHR194A突变体基因和质粒复制所需的其它元件；也可以是表达载体，包含CA7α-HSDHR194A突变体基因和能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为插入了CA7α-HSDHR194A突变体基因的pGEX-6p-1载体。本专利技术提供的重组细胞，可以是包含克隆载体的重组细胞，例如E.coliDH5α，通过培养细胞使细胞内的CA7α-HSDHR194A突变体基因复制；也可以是包含表达载体的细胞，在适当的条件下培养细胞，例如，加入适量的IPTG，16℃诱导CA7α-HSDHR194A突变体蛋白的表达。本专利技术提供一种催化剂，其有效成分包括CA7α-HSDHR194A突变体。所述催化剂也可以与其它适合的催化剂同时使用，从而提高酶催化效率或者在同一反应体系中先后进行两种催化反应。本专利技术的CA7α-HSDHR194A突变体，在15-37℃、pH6.0-11.0条件下能够催化羰基不对称还原反应。附图说明图1.7α-、7β-HSDH联合转化CDCA制备UDCA。图2.OverlappingPCR(重叠PCR)构建R194A突变体基因的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，M为DNAMarker；1和2为R194A的overlappingPCR产物。图3.质粒双酶切鉴定结果；其中，M为DNAMarker；1和2为酶切后的重组质粒。图4.撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体R194A的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质分子量标准(Marker)；1为R194A突变体蛋白。图5.NADPH的标准曲线；其中，横坐标为NADPH溶液的浓度，纵坐标为每个浓度的NADPH溶液在340nm处的光吸收值。具体实施方式下面结合具体实施例进一步描述本专利技术，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本专利技术的范围。主要试剂：pGEX-6p-1为已知载体，本实验室保存；E.coliBL21细胞为本实验室保存；Lysisbuffer，配制而得，10mMpH7.3的PBS含有PMSF0.1mM、亮肽素Leupeptin0.5mg/mL；GlutathioneSepharose4B，购买自GEHealthcare，货号：10223836；PreScissionProt本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种撒丁岛梭菌7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的7α‑羟基类固醇脱氢酶的第194位氨基酸由Arg变为Ala所得。

【技术特征摘要】
1.一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，是氨基酸序列为SEQIDNO：1的7α-羟基类固醇脱氢酶的第194位氨基酸由Arg变为Ala所得。2.编码权利要求1所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。4.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。5.一种载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因或权利要求4所述的表达盒。6.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求2所述的基因或权利要求4所述的表达盒或权利要求5所述的载体。7.一种制备权利要求1所述的撒丁岛梭菌7α...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伯初，娄德帅，祝连彩，谭君，王玥，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50