一种快速简便烟粉虱成虫RNA干扰方法技术

本发明专利技术公开了一种饲喂法进行烟粉虱RNA干扰的方法，包括如下步骤：1）烟粉虱饲喂营养液准备；2）实验装置材料准备；3）烟粉虱饲喂：首先准备好dsRNA；取一小块封口膜，覆盖在玻璃管一端，然后加入上述配制好的营养液，再取一小块封口膜覆盖在液滴上，制作一个双层封口膜形成的含有营养液和dsRNA的小袋；将烟粉虱从另一端口中放飞管内，然后塞上黑色棉塞，包上遮光管套；将玻璃管放置在培养箱中，饲喂小袋的方向朝向光源。本发明专利技术利用烟粉虱的趋光性，创造一个黑暗的环境，从而使得烟粉虱能够快速取食含有dsRNA的饲喂液，显著的降低了成虫的死亡率，具有很高的时效性和良好的重复性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物领域，涉及一种快速简便烟粉虱成虫RNA干扰方法体系构建。
技术介绍
烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是一种危害严重的蔬菜花卉和园艺作物的世界性害虫，具有寄主范围广泛，繁殖率高，传播植物病毒，暴发性强和易于产生抗药性等特点。烟粉虱的危害包括直接取食植物汁液使得植物萎蔫，分泌蜜露形成煤污病从而阻抑光合作用，更为严重的是烟粉虱能够传播多种植物病毒，如烟粉虱能够传播植物双生病毒番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)，造成番茄严重减产甚至绝产。。烟粉虱在漫长的进化过程中形成了30余种不同的隐种，其中B和Q型烟粉虱是全世界危害最为严重的两个隐种，B型烟粉虱起源于中亚-亚细亚地区，是一种广泛认可的“世界超级害虫”；二十世纪九十年代在欧洲伊比利亚半岛首次发现Q型烟粉虱，具有更强的抗药性和传毒能力，迅速传播到全世界其他地区。化学防治是害虫综合治理的一种重要方式，特别是一些新型的环境友好型的杀虫剂，如新烟碱类杀虫剂，具有防治效果好，毒性低，选择性好，是防治烟粉虱危害的重要杀虫剂，但是随着长期连续施用，田间烟粉虱产生了较为严重的抗药性，对于烟粉虱抗药性机制的研究为田间生产提供重要的理论依据，也为烟粉虱的综合治理提供了保障。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引起的，在体内通过结合同源的mRNA,高效特异性降解同源mRNA,从而抑制基因表达或使基因功能丧失的一种现象，是普遍存在与生物体内一种重要的遗传行为，它又被称为基因沉默(genesilencing)或基因敲除(knock-down)。1990年，Jorgensen等在牵牛花的研究中，设计在一个强启动子后加上一个紫色色素基因，设想把牵牛花的紫色加深，但是他们的研究并未达到理想中的效果，牵牛花的花朵的颜色并未出现紫色加深的现象，而是出现了杂色，还有白色，他们把这种内源基因与导入的外源基因同时被抑制的这种现象的解释称其为共抑制。1994年，Cogoni等研究者提出了基因抑制(quelling)的假说，他们的研究表明，在粗糙红色链孢霉菌中导入合成类胡萝卜素所需的基因，导致粗糙红色链孢霉菌自身基因约30％的失活。1995年，康奈尔大学的Guo等在性腺的合胞体细胞中注射入par-1基因的反义RNA后，在被注射秀丽新小杆线虫的亲本和子代的体细胞中，均出现par-1基因敲除或功能缺失的表型；仅注射par-l基因的正义RNA链后，同样抑制了该基因的表达。但研究者没有给出合理的解释。1998年，CraigMello和AndrewFire研究证实，出现注入正义或反义RNA后，par-1发生基因缺失或抑制的现象的原因是微量dsRNA在体外转录的RNA中被不小心带入了，而恰恰是这种被带入的dsRNA引起了基因的沉默或抑制，而且还发现只是单纯通过导入dsRNA引起的沉默效果远远大于正义链或反义链导入引起的沉默效果。为了进一步验证，研究者将体外转录的单链RNA注射到线虫中，发现该基因抑制的效果明显减弱，但是经纯化的双链RNA引起的沉默效果则大大不同，能够特异性高效抑制该基因的表达。于是将此现象命名为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)。此后在自然界中陆续发现了RNAi的现象，只是不同物种的表现形式有所不同。比如在果蝇、真菌、拟南芥、水螅、斑马鱼等多种真核生物中，发现RNAi现象都是由于dsRNA介导引起的RNAi效应。而在植物中被称作转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)、共抑制及基因抑制等。1999年，Hamilton等的研究中发现在不存在转录后基因沉默的植株中存在很多小RNA分子，这些小RNA分子长度大约为25个碱基，它们可以与靶标基因的正义和反义链分别发生互补。这一现象的发现成为揭示RNAi作用机制第一条关键线索。随后2000年，Zamore等的研究结果表明，利用外源dsRNA导入体外培养的果蝇细胞中，在ATP的帮助下，这些dsRNA被降解成为大约21-23nt的小RNA(smallinterferingRNA，siRNA)后，从而引发RNAi现象。2001年，Bernstein等在果蝇的研究中发现了Dicer，这种酶可以特异性降解dsRNA，被命名为Dicer酶，其在进化上高度保守，属于RNaseIII家族中的一员[89]。Wianny等和Svoboda等的研究中，也证实dsRNA能够引发RNAi效应，在小鼠胚胎中和卵母细胞中都存在这种现象。Elbashir等证实21nt的siRNA能够能有效抑制Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达，同时它们可以防止激活dsRNA依赖的蛋白激酶和2′、5′-寡聚腺苷酸合成酶进行信号转导途径。2002年，Brummelkamp等利用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA的表达载体pSUPER，同时证实转染pSUPER载体后，可以特异性抑制哺乳动物细胞内的目的基因的表达；该研究为RNAi技术应用于基因治疗研究奠定了基础。在功能基因组中：RNAi与传统的基因敲除技术和反义技术相比较而言，是一种有效的工具，因其具有周期短、高效、特异、操作简单等优点。目前，RNAi对于基因的筛选工作起到事半功倍的效果。RNAi可以把基因组测序结果和EST文库建立的dsRNA文库用于大规模的基因组筛选。同时，在mRNA—表型对应关系的建立上起到了关键的作用。通过DNA芯片的原理，把RNAi与微电子相结合的手段，成功构建RNAi的芯片，然后在这种组成型的芯片上点阵上构建多种siRNA的组成型的细胞，产生各种功能基因失活的表型库，成功建立mRNA与表型对应的关系库。同时，还可以利用DNA芯片技术，得到不同基因间的的网络库。还可以通过酶切，把酶切后的片段克隆到不同的载体上，人工构建随机RNAi文库，达到完全可以抑制基因表达的目的，克服了RNAi文库细胞已知基因覆盖面窄的缺陷，构成基因的RNAi文库，该文库的建立为筛选工作做出了巨大贡献，因其文库中搭载了不同的siRNA载体，是众多易于保存的siRNA载体的混合体。在信号传导途径中，RNAi起着重要作用。依据RNAi可以产生不同功能基因丧失的表型，如果在信号传导中把某个途径打断，将出现多种表型，从而鉴定出是哪些mRNA被降解了，通过这些mRNA分子辨别出，参与该信号传导中信号分子。还可以通过敲除某一个信号分子，鉴别出与该信号分子与其他信号分子间的关系。研究者还发现许多的miRNA可能参与发育过程中基因调节的功能，如在线虫的幼虫发育和拟南芥花的发育中都存在一些miRNA起着关键的调节作用。在疾病治疗中的应用：在许多世界性传染病和恶性肿瘤基因治疗急速发展的今天，RNAi因其高效，特异的基因敲除特点，已经被广泛普遍应用于医学的发展。在疾病的治疗过程中，RNAi可以选择性的选定病灶的特定位点，特异性的抑制特定基因的序列，起到消除病症的作用，对于一些有明确作用机制的特定的肿瘤细胞，可以利用RNAi技术使发生突变的区域产生细胞凋亡诱导作用，如含BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞。此外，还可以杀伤特异性肿瘤细胞的，利用RNAi技术可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种饲喂法进行烟粉虱RNA干扰的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）烟粉虱饲喂营养液准备：配制30%的蔗糖溶液和5%的酵母浸出物；2）实验装置材料准备：准备透明玻璃管，封口膜，黑色的棉塞和遮光布制作的能够覆盖上述玻璃管的庶光管套，以及一个能够控温控湿的光照培养箱；3）烟粉虱饲喂：首先准备好dsRNA；取一小块封口膜，覆盖在玻璃管一端，然后加入上述配制好的营养液，再取一小块封口膜覆盖在液滴上，制作一个双层封口膜形成的含有营养液和dsRNA的小袋；将烟粉虱从另一端口中放飞管内，然后塞上黑色棉塞，包上遮光管套；将玻璃管放置在培养箱中，饲喂小袋的方向朝向光源。

【技术特征摘要】
1.一种饲喂法进行烟粉虱RNA干扰的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）烟粉虱饲喂营养液准备：配制30%的蔗糖溶液和5%的酵母浸出物；2）实验装置材料准备：准备透明玻璃管，封口膜，黑色的棉塞和遮光布制作的能够覆盖上述玻璃管的庶光管套，以及一个能够控温控湿的光照培养箱；3）烟粉虱饲喂：首先准备好dsRNA；取一小块封口膜，覆盖在玻璃管一端，然后加入上述配制好的营养液，再取一小块封口膜覆盖在液滴上，制作一个双层封口膜形成的含有营养液和dsRNA的小袋；将烟粉虱从另一端口中放飞管内，然后塞上黑色棉塞，包上遮光管套；将玻璃管放置在培养箱中，饲喂小袋的方向朝向光源。2.如权利要求2所述的方法，其中第3）步中，在培养箱中的培养条件为光照14：10，湿度80%。3.如权利要求2所述的方法，其中第1）步配制的营养液采用0.22µm的细菌滤器进行过滤后使用。4.如权利要求2所述的方法，其中第2）...

【专利技术属性】
技术研发人员：张友军，杨鑫，谢文，王少丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11