表柔红霉素的纯化制造技术

本发明专利技术涉及用于纯化表柔红霉素、特别是去除诸如在表柔红霉素的生物技术生产中作为副产物形成的杂质表费多霉素的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及用于纯化表柔红霉素(epidaunorubicin)，特别是分离表柔红霉素和表费多霉素(epi-feudomycin)的方法，所述表费多霉素在表柔红霉素的生物技术生产中形成为副产物。表柔红霉素是柔红霉素的4'-差向异构体，它属于糖苷类并且表示蒽环类的抗生素。它主要用作表柔比星的前体，表柔比星在乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、肉瘤、胃癌和其他实体类型的癌症的化疗中用作细胞抑制剂。表柔红霉素可以合成、半合成和生物技术制备。在生物技术生产中，使用各种波赛链霉菌(Streptomycespeucetius)菌株。表柔红霉素可以由以下通式（I）表示：。在表柔红霉素的微生物合成中，出现的问题是，除了所需产物之外，尤其形成作为副产物的表费多霉素，表费多霉素由于其结构相似性而非常难以与表柔红霉素分离。该副产物的存在对由表柔红霉素在随后的方法步骤中形成的表柔比星的产率和纯度是极其不利的。通常，表柔红霉素从发酵液中的分离和纯化通过液-液提取、层析法和结晶而进行。然而，由于表费多霉素的存在，这需要复杂的工艺和导致相对高的表柔红霉素的损失。EP1990405A1描述了适合于表柔红霉素的生物技术生产的不同微生物菌株。表柔红霉素从发酵液中的分离通过在碱性pH值下用氯仿提取进行。然后将所得的粗制混合物进一步用氯仿作为流动相进行层析纯化。在最后一步中，表柔红霉素通过加入丁醇和调整酸性pH值而结晶。EP2301943B1描述了从醇/氯仿的混合物中结晶表柔红霉素盐酸盐，其中在60℃的温度下加入醇。EP0030295B1公开了表柔红霉素的合成制备。WO2010/028667描述了在吸附树脂的帮助下从发酵液中提取13-DHED、表柔红霉素和表费多霉素。EP2042608B1描述了从含有13-DHED、表柔红霉素和费多霉素的发酵液中提取糖苷配基。通过氯仿在微碱性pH值下从水相中提取糖苷。通过饱和NaHCO3溶液使pH值保持稳定。从发酵液中纯化表柔红霉素的常规方法需要高的技术和财务花费。表柔红霉素和特别是表费多霉素由于这两种化合物的结构相似性而特别难以分离，从而使得可接受纯度的表柔红霉素仅仅在相当高的产率损失的情况下才能实现。由于表费多霉素的分离困难，该杂质在从表柔红霉素衍生的产物中也会被发现，这对于转化为表柔比星是尤其不利的。另一方面，高纯度和高产率对于后续的从表柔红霉素至表柔比星的转化尤其重要。因此，需要一种可以有效地将副产物表费多霉素与所希望的产物表柔红霉素分离的方法，且该方法不会由于所述分离和纯化步骤而显著降低表柔红霉素的产率。因此，本专利技术的目的在于，提供一种在微生物生产之后可以有效地将表柔红霉素和表费多霉素分离的方法，其中纯化的表柔红霉素的产率比现有技术中已知的常规方法所获得的更高。该目的通过独立权利要求的主题而实现。从属权利要求描述了优选的实施方案。本专利技术的目的是用于纯化表柔红霉素的方法，其包括下列步骤：a)提供包含表柔红霉素、表费多霉素和至少一种含卤素的溶剂的混合物；b)将该混合物的pH值调整到5.0至7.5的范围；c)将步骤b)的混合物加热到超过25℃；和d)纯化所述表柔红霉素，其特征在于，基于所述混合物的总体积，在步骤a)和b)的混合物中的具有1至5个碳原子的醇的含量不超过5体积%。不受理论的束缚，可以认为在根据本专利技术的方法的条件下，表费多霉素被选择性地分解并且所获得的降解产物更容易与所希望的表柔红霉素分离。可以认为，根据本专利技术的方法也导致了反应混合物的转化并且因此导致表费多霉素的减少。质谱分析表明，糖发生裂解(splitoff)并且剩余的环被芳构化（aromatized）。进一步认为，这是表费多霉素的特异性分解(disintegration)，因为不能检测到表柔红霉素的降解产物。在这方面，在根据本专利技术的方法中的分解不同于也可以应用到表柔红霉素的传统的蒽环类酸性水解。根据本专利技术的方法开始于作为原料的表柔红霉素，将其在几个步骤中纯化。表柔红霉素的来源和生产方法不受任何限制。例如，可以使用含有一部分表费多霉素的商购的表柔红霉素，这样的表柔红霉素不适于其他应用。在根据本专利技术的纯化方法的一个优选的实施方案中，步骤a)的混合物中的表柔红霉素借助生物技术方法例如合适的微生物而获得。优选地，表柔红霉素与表费多霉素一起存在于发酵液中。合适的微生物包括例如放线菌纲(actinobacteria)的细菌，特别是下列的菌株：链霉菌属物种(Streptomycessp.)，例如波赛链霉菌、S.coeruloruidus、灰色链霉菌(S.griseus)、链霉菌属C5种(Streptomycessp.C5)、波赛链霉菌青灰变种(S.peicetiusvar.caesius)和S.bifurcus。也可以使用修饰的菌株或突变体。优选地，根据本专利技术的方法的步骤a)的混合物中的表柔红霉素和表费多霉素借助从发酵液中的提取而获得。该提取可以包括几个步骤，例如借助合适的聚合树脂的提取并然后液体提取（liquidextraction）。混合物a)优选从发酵液的液体提取的浓缩物和任选通过添加含卤素的溶剂而获得。在一个特别优选的实施方案中，步骤a)中的起始混合物具有碱性的pH值，特别优选范围为8至10.5的pH值。在混合物a)中，表柔红霉素在至少一种含卤素的溶剂存在的情况下以溶解的形式存在。在一个优选的实施方案中，所述含卤素的溶剂选自氯化的溶剂，特别是氯仿(CHCl3)。基于所述混合物的总体积，在根据本专利技术的方法的步骤a)和b)的混合物中的具有1至5个碳原子的醇的含量为最多5体积%。已令人惊奇地发现，具有1至5个碳原子的醇的更高含量导致降低的反应速率，而降低的反应速率进而负面地影响表柔红霉素的纯度。因此，优选这样的本专利技术的实施方案，其中在步骤a)和b)的混合物中的具有1至5个碳原子的醇的含量为最多4体积%，特别优选0.1至4体积%，特别是1.0至3体积%，其总是基于所述混合物的总体积。在本专利技术范围中的醇含量确保了表柔红霉素保持完全溶解和所述反应在令人满意的时间范围内发生。还优选这样的本专利技术的实施方案，其中具有1至5个碳原子的醇选自甲醇、丁醇、丙醇、乙醇、异丙醇、戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2,2-二甲基丙醇和异丁醇。在一个特别优选的实施方案中，具有1至5个碳原子的醇是甲醇。此外，优选这样的实施方案，其中基于所述混合物的总体积，在步骤a)的混合物中的水含量为最多1体积%。另外令人惊奇地发现，如果在步骤a)的混合物中的表柔红霉素的浓度不多于13g/L，则借助本专利技术的方法获得的表柔红霉素具有特别高的纯度。因此，优选这样的实施方案，其中在步骤a)的混合物中的表柔红霉素的浓度不多于13g/L，优选6至13g/L，特别是8至13g/L。已经发现，如果在步骤a)的混合物中的表柔红霉素的浓度在该范围中，则可以阻止不希望的副反应和反应的中断。例如，可以减少表柔红霉素沉淀的风险(danger)。表柔红霉素的沉淀会导致不希望的产率损失，因为沉淀的表柔红霉素会被从纯化过程中除去。此外观察到，待分离的杂质表费多霉素与表柔红霉素一起沉淀，因此沉淀不是一个合适的纯化方法。根据本专利技术的用于表柔红霉素纯化的方法的步骤b)，将所述混合物的pH值调整到5.0至7.5的范围。令人惊本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于纯化表柔红霉素的方法，其包括下列步骤：a) 提供包含表柔红霉素、表费多霉素和至少一种含卤素的溶剂的混合物；b) 将所述混合物的pH值调整到5.0至7.5的范围；c) 将步骤b) 的混合物加热到超过25℃；和d) 纯化所述表柔红霉素，其特征在于，基于所述混合物的总体积，在步骤a) 和b) 的混合物中具有1至5个碳原子的醇的含量为最多5体积%。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.30 DE 102014208194.71.用于纯化表柔红霉素的方法，其包括下列步骤：a)提供包含表柔红霉素、表费多霉素和至少一种含卤素的溶剂的混合物；b)将所述混合物的pH值调整到5.0至7.5的范围；c)将步骤b)的混合物加热到超过25℃；和d)纯化所述表柔红霉素，其特征在于，基于所述混合物的总体积，在步骤a)和b)的混合物中具有1至5个碳原子的醇的含量为最多5体积%。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，基于所述混合物的总体积，在步骤a)的混合物中的水的含量为最多1体积%。3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述具有1至5个碳原子的醇选自甲醇、丁醇、异丙醇、乙醇、丙醇、戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2,2-二甲基丙醇和异丁醇。4.根据权利要求1至3中一项或多项的方法，其特征在于，在步骤a)中的表柔红霉素的浓度为6至13g/L，优选8至13g/L。5.根据权利要求1至4中一项或多项的方法，其特征在于，所述含卤素的溶剂选自氯化的溶剂，特别是氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：H宾德纳格尔，T库纳里，
申请(专利权)人：尼德制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE