使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物技术

在此披露了在将有效载荷靶向靶核酸或编辑靶核酸中有用的方法和组合物，其中统治型gRNA分子被用于靶向、任选地失活Cas9分子或Cas9分子/gRNA复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年11月7日提交的美国临时申请号61/901,215的权益，将其内容通过引用以其全文结合在此。专利
本专利技术涉及用于编辑靶核酸序列或将有效载荷递送到靶核酸序列的CRISPR相关方法和组分。专利技术背景CRISPR(规律间隔成簇短回文重复)在细菌中进化为用于抵御病毒攻击的适应性免疫系统。在暴露于病毒后，病毒DNA的短区段被整合进CRISPR基因座中。RNA是从包括病毒序列的CRISPR基因座的一部分转录来的。该RNA含有与病毒基因组互补的序列，介导将Cas9蛋白靶向病毒基因组中的靶序列。Cas9蛋白切割病毒靶标并且由此使其沉默。最近，CRISPR/Cas系统已经被改适成用于在真核细胞中进行基因组编辑。位点特异性双链断裂(DSB)的引入允许通过两种内源DNA修复机制之一(非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR))改变靶序列。CRISPR/Cas系统还已经用于基因调节，包括在不改变靶序列的情况下的转录抑制和激活。基于CRISPR/Cas系统的靶向的基因调节使用无酶促活性的Cas9(又称催化上失活的Cas9)。尽管改适CRISPR/Cas系统用于在真核细胞中进行基因组编辑最近取得了进展，但是仍然需要改进这些系统的调节和控制用于在真核细胞中使用。专利技术概述在此披露了可以用于靶向靶DNA中的特定位置的方法和组合物，例如与gRNA分子复合的Cas9分子。取决于在披露的方法和组合物中使用的Cas9分子/gRNA分子复合物，可以实现靶核酸的特异性编辑或有效载荷的递送。使用或包括编码Cas9分子或gRNA分子的核酸(例如，DNA)的方法和组合物可以另外使用或包括“统治型(governing)gRNA分子”。统治型gRNA分子可以与Cas9分子复合，以使Cas9系统的组分失活或沉默。在一个方面中，本披露的特征是一种包含靶向结构域的gRNA分子(在此称为统治型gRNA分子)，该靶向结构域靶向Cas9系统的组分。在一个实施例中，统治型gRNA分子靶向以下项并使其沉默：(1)编码Cas9分子的核酸(即，靶向Cas9的gRNA分子)，(2)编码gRNA分子的核酸(即，靶向gRNA的gRNA分子)，或(3)被设计成与细胞中的其他核酸序列具有最小同源性以最小化脱靶切割的被工程化到Cas9组分中的核酸序列(即，靶向工程化的控制序列的gRNA分子)。可以对统治型gRNA的靶向序列进行选择，以增加Cas9系统的调节或控制和/或以减小或最小化该系统的脱靶效应，例如，统治型gRNA可以通过使编码Cas9分子的核酸失活(例如，切割)而最小化不希望的切割，例如，Cas9介导的靶核酸改变或Cas9的脱靶切割之后的“再切割”。在一个实施例中，统治型gRNA对Cas9分子/gRNA分子复合物的表达或活性水平施加将时间限制或其他一种或多种限制。在一个实施例中，统治型gRNA减少脱靶或其他不想要的活性。统治型gRNA的靶序列可以被布置在Cas9编码序列的控制区或编码区中。这可以是Cas9序列或非Cas9序列，例如被选择用于减小或最小化脱靶效应或导致脱靶效应减小或最小化的序列。沉默或失活可以通过切割靶向的核酸序列或通过将Cas9分子/统治型gRNA分子复合物与靶向的核酸序列结合来实现。在一个方面中，本披露的特征是一种靶向Cas9分子(任选地使其失活)的gRNA分子。在一个实施例中，gRNA分子靶向编码Cas9分子的核酸序列。例如，编码Cas9分子的序列可以包括以下项中的一项或多项：编码Cas9分子的氨基酸序列的序列，编码Cas9分子的氨基酸序列、包括非翻译序列的序列，或编码Cas9分子的氨基酸序列、包括非转录序列的序列。在一个实施例中，Cas9分子是eaCas9分子。在另一个实施例中，Cas9分子是eiCas9分子。在一个实施例中，gRNA被配置成在编码Cas9分子的核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件。在一个实施例中，gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在编码Cas9分子的核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件。在一个实施例中，gRNA分子：靶向核酸序列的Cas9分子-氨基酸编码序列；被配置成在核酸序列的Cas9分子-氨基酸编码序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在核酸序列的Cas9分子-氨基酸编码序列中提供Cas9分子介导的切割事件。在一个实施例中，gRNA分子：靶向核酸序列的非编码序列；被配置成在核酸序列的非编码序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在核酸序列的非编码序列中提供Cas9分子介导的切割事件。在一个实施例中，gRNA分子：靶向核酸序列的非翻译序列；被配置成在核酸序列的非翻译序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在核酸序列的非翻译序列中提供Cas9分子介导的切割事件。在一个实施例中，gRNA分子：靶向Cas9分子-氨基酸编码区的5’核酸序列；被配置成在Cas9分子-编码区的5’核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在核酸序列的Cas9分子-编码区的5’中提供Cas9分子介导的切割事件。在一个实施例中，gRNA分子：靶向编码Cas9分子-编码区的Cas9分子3’的核酸序列；被配置成在Cas9分子-编码区的3’核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在核酸序列的Cas9分子-编码区的3’中提供Cas9分子介导的切割事件。在一个实施例中，gRNA分子：靶向核酸序列的启动子区；被配置成在核酸序列的启动子区中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在核酸序列的启动子区中提供Cas9分子介导的切割事件，其中该启动子区与Cas9分子氨基酸编码区功能性地连接。在一个实施例中，gRNA分子：靶向核酸序列的Cas9分子内含子序列；被配置成在核酸序列的Cas9分子内含子序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在核酸序列的Cas9分子内含子序列中提供Cas9分子介导的切割事件。在一个实施例中，Cas9分子是化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9分子。在另一个实施例中，Cas9分子是金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9分子。在一个实施例中，gRNA分子选自表E1-E6。在另一个实施例中，gRNA分子选自表E7-E12。在一个实施例中，gRNA是嵌合gRNA。在另一个实施例中，gRNA是模块化gRNA。在一个实施例中，统治型gRNA分子靶向有待负向调节的Cas9系统组分的编码序列或控制区(例如，启动子)。例如，gRNA可以靶向Cas9的编码序列，或调节Cas9编码序列的表达的控制区(例如，启动子)。在一个实施例中，统治型gRNA(例如，靶向Cas9的gRNA分子)或编码它的核酸被单独地引入，例如晚于Cas9分子或编码它的核酸。例如，第一载体(例如病毒载体，例如AAV载体)可以引入编码Cas9和一种或多种gRNA的核酸，并且第二载体(例如病毒载体，例如AAV载体)可以引入编码统治型gRNA分子(例如，靶向Cas9的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向Cas9分子的gRNA分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.07 US 61/901,2151.一种靶向Cas9分子的gRNA分子。2.如权利要求1所述的gRNA分子，其中该gRNA分子靶向编码该Cas9分子的核酸序列，其中编码该Cas9分子的核酸序列包括以下项中的一项或多项：编码该Cas9分子的氨基酸序列的序列，编码该Cas9分子的氨基酸序列、包含非翻译序列的序列，或编码该Cas9分子的氨基酸序列、包含非转录序列的序列。3.如权利要求1或2所述的gRNA分子，其中该Cas9分子是eaCas9分子。4.如权利要求1或2所述的gRNA分子，其中该Cas9分子是eiCas9分子。5.如权利要求1-4中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA分子被配置成在编码该Cas9分子的核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件。6.如权利要求1-5中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在编码该Cas9分子的核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件。7.如权利要求1-6中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA分子：靶向该核酸序列的Cas9分子氨基酸编码序列；被配置成在该核酸序列的Cas9分子氨基酸编码序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在该核酸序列的Cas9分子氨基酸编码序列中提供Cas9分子介导的切割事件。8.如权利要求1-6中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA分子：靶向该核酸序列的非编码序列；被配置成在该核酸序列的非编码序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在该核酸序列的非编码序列中提供Cas9分子介导的切割事件。9.如权利要求1-6中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA分子：靶向该核酸序列的非翻译序列；被配置成在该核酸序列的非翻译序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在该核酸序列的非翻译序列中提供Cas9分子介导的切割事件。10.如权利要求1-6中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA分子：靶向Cas9分子氨基酸编码区的5’核酸序列；被配置成在Cas9分子编码区的5’核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在该核酸序列的Cas9分子编码区的5’提供Cas9分子介导的切割事件。11.如权利要求1-6中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA分子：靶向编码Cas9分子编码区的Cas9分子3’的核酸序列；被配置成在Cas9分子编码区的3’核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在该核酸序列的Cas9分子编码区的3’提供Cas9分子介导的切割事件。12.如权利要求1-6中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA分子：靶向该核酸序列的启动子区，被配置成在该核酸序列的启动子区中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在该核酸序列的启动子区中提供Cas9分子介导的切割事件，其中该启动子区与Cas9分子氨基酸编码区功能性地连接。13.如权利要求1-6中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA分子：靶向该核酸序列的Cas9分子内含子序列；被配置成在该核酸序列的Cas9分子内含子序列中提供Cas9分子介导的切割事件；或包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在该核酸序列的Cas9分子内含子序列中提供Cas9分子介导的切割事件。14.如权利要求1-13中任一项所述的gRNA分子，其中该Cas9分子是化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9分子。15.如权利要求1-13中任一项所述的gRNA分子，其中该Cas9分子是金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9分子。16.如权利要求1-15中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA是嵌合gRNA。17.如权利要求1-15中任一项所述的gRNA分子，其中该gRNA是模块化gRNA。18.一种核酸，包含编码统治型gRNA分子的序列。19.如权利要求18所述的核酸，其中该统治型gRNA分子包括靶向Cas9分子的gRNA分子。20.一种核酸，包含编码如权利要求1-17中任一项所述的gRNA分子的序列。21.如权利要求20所述的核酸，其中该核酸是纯化的。22.一种载体，其包含如权利要求18-21中任一项所述的核酸。23.如权利要求22所述的载体，其中该载体是病毒载体。24.如权利要求23所述的载体，其中该病毒载体是AAV载体。25.一种核酸，包含：a)第一核酸序列，其编码统治型gRNA分子；和b)第二核酸序列，其编码Cas9分子。26.如权利要求25所述的核酸，其中该统治型gRNA分子包括靶向Cas9分子的gRNA分子。27.如权利要求26所述的核酸，其中该靶向Cas9分子的gRNA分子靶向编码该Cas9分子的该第二核酸序列。28.如权利要求25-27中任一项所述的核酸，其中该Cas9分子是eaCas9分子。29.如权利要求25-27中任一项所述的核酸，其中该Cas9分子是eiCas9分子。30.如权利要求25-29中任一项所述的核酸，其中该gRNA分子被配置成在该第二核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件。31.如权利要求25-30中任一项所述的核酸，其中该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域被配置成在该第二核酸序列中提供Cas9分子介导的切割事件。32.如权利要求25-31中任一项所述的核酸，其中该gRNA分子是如权利要求7-19中任一项所述的gRNA分子并且靶向该第二核酸序列。33.如权利要求25-32中任一项所述的核酸，其中组分a)和组分b)被提供在同一核酸分子上。34.如权利要求25-32中任一项所述的核酸，其中组分a)和组分b)被提供在不同核酸分子上。35.如权利要求25-34中任一项所述的核酸，其被配置成使得从该核酸转录的靶向Cas9的gRNA与从该核酸产生的Cas9分子形成复合物。36.如权利要求35所述的核酸，其中该复合物能够使包括或编码该Cas9分子序列的核酸序列失活。37.如权利要求36所述的核酸，其中该失活包括切割。38.如权利要求25-37中任一项所述的核酸，其中该第一核酸序列在第一控制区的控制下并且该第二核酸序列在第二控制区的控制下，并且该第一控制区和该第二控制区是不同的。39.如权利要求38所述的核酸，其中该第一控制区和该第二控制区中的一个是组成型启动子并且一个是诱导型启动子。40.如权利要求25-39中任一项所述的核酸，其中该第一核酸序列和该第二核酸序列被差异性表达。41.如权利要求40所述的核酸，其中该差异性表达是就表达水平而言的差异性表达或时间差异性表达。42.如权利要求25-41中任一项所述的核酸，其进一步包含：c)第三核酸序列，其编码第二gRNA分子，该第二gRNA分子包含与靶核酸互补的靶向结构域，其中该第二gRNA不靶向b)。43.如权利要求42所述的核酸，其中该第一核酸序列在第一控制区的控制下；该第二核酸序列在第二控制区的控制下；并且该第三核酸序列在第三控制区的控制下，其中，该第一控制区不同于该第二控制区和/或该第三控制区。44.如权利要求25-43中任一项所述的核酸，进一步包含模板核酸序列。45.如权利要求25-44中任一项所述的核酸，其中该核酸是纯化的。46.一种载体，包含如权利要求25-45中任一项所述的核酸。47.如权利要求46所述的载体，其中该载体是病毒载体。48.如权利要求47所述的载体，其中该病毒载体是AAV载体。49.一种组合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·张，D·帕莱斯特朗，B·戴维松，J·马塔芬克，E·罗德里格斯，A·鲍里斯，
申请(专利权)人：爱迪塔斯医药有限公司，布罗德研究所有限公司，爱荷华大学研究基金会，麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：美国;US