本发明专利技术提供一种医用超纯高活性鱼皮胶原的制备方法，包括原料处理、胶原提取和提取物纯化等步骤。采用本发明专利技术的医用超纯高活性鱼皮胶原制备方法，可充分有效的去除制备过程中产生的部分降解或者断裂的所有不具备300KDa分子量及三螺旋结构的胶原，以及鱼皮中含量较高的Ⅲ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白及其他非胶原成分均可有效去除，获得Ⅰ型胶原含量≥99%胶原蛋白。本方法改用AKTA蛋白纯化系统，搭配凝胶分子筛层析柱进行纯化，根据不同分子量物质出峰时间不同，准确收集Ⅰ型胶原蛋白所出峰流出液，即可得超纯高活性Ⅰ型胶原蛋白。本方法较现有方法，有效去除降解的或者断裂的所有不具备300KDa分子量及三螺旋结构的胶原，所得产品超纯单一，具有更加广泛的使用范围。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医用材料制备领域，尤其涉及一种从鱼皮中提取可作为生物医用材料的天然超纯高活性高分子胶原的方法。
技术介绍
胶原蛋白(collagen)是一类在生物体中广泛存在的纤维状结构蛋白质,根据其分子结构的差异,可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等多种类型,其中Ⅰ型胶原蛋白是生物体中最主要的存在形式,其结构特征是由两条а1和一条а2肽链形成的三螺旋结构。由于胶原蛋白具有良好的生物相容性、加工适应性和低免疫排斥性,近年来其作为医学组织工程的主要生物材料在人造皮肤、人造血管、创伤修复等领域均得到了广泛的应用。随着我国工业发展，我国每年有数量庞大的废弃鱼体组织被丢弃，其中含有丰富的胶原蛋白。随着近段时间，疯牛病和口蹄疫在全球范围内爆发，带来了哺乳动物来源胶原蛋白的安全问题。因此，鱼体组织成为理想的胶原蛋白源。现有技术中主要是利用深海鱼类的鱼皮，加工得到医用级生物材料用鱼皮胶原，鱼皮酶解之后用盐析法将胶原沉淀析出，后经复溶和除盐工艺将盐析加入氯化钠除去，该方法所得胶原蛋白纯度较低，不能有效分离部分降解或断裂的Ⅰ型胶原蛋白，同时部分Ⅲ型胶原、Ⅴ型胶原和其它杂质均会残留于鱼皮胶原蛋白中。本方法可有效分离去除部分降解或断裂的Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原、Ⅴ型胶原和其它杂质，获得具有完好三螺旋结构的分子量为300KDa超纯度高活性胶原，Ⅰ型胶原含量≥99%。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种医用超纯高活性鱼皮胶原蛋白的制备方法，按照以下步骤进行：1.一种医用超纯高活性鱼皮胶原的制备方法，其特征在于，所述鱼皮胶原制备按照以下步骤进行：1）原料处理：将清洗干净并脱水后的罗非鱼皮绞碎成0.5-5cm2的小块后，加入料液比1:25（w/w）的2-15%正丁醇脱脂，0-4℃搅拌8-12小时后排除废液，并重复3-4次，用去离子水清洗。将清洗后的鱼皮以料液比1:25（w/w）放入0.05-0.2M的NaOH溶液中搅拌32-48小时，每间隔8-12小时更换所述NaOH溶液一次，再用去离子水充分清洗经碱溶液处理后的鱼皮直至中性；2）胶原提取：将清洗后的鱼皮以料液比1:5-20（w/w）的比例放入0.05-0.5M的酸性溶液中，加入0.01%-0.1%的蛋白酶搅拌24-60小时，酶解处理得酶解胶原液；3）提取物纯化：加入料液比1:50-500（w/w）的醋酸钠和料液比1:50-500（w/w）的氯化钠到酶解胶原液中，用酸或碱液调pH3-9，用过滤设备过0.22微米滤膜，用AKTA纯化系统进行纯化，同时使用凝胶分子筛柱，用样品接收器准确接收Ⅰ型胶原所出峰流出液。流出液加入无水乙醇溶液，直至所述胶原液中的乙醇含量达到40-75%，静置，过滤，得胶原蛋白，无水乙醇脱水，低温真空干燥得胶原蛋白粉末。本专利技术的有益效果是：本方法使用AKTA蛋白纯化系统搭配凝胶分子筛色谱柱较现有方法有很大优势：现有方法通过盐析法使胶原蛋白从溶液中析出，同时对胶原蛋白进行一定的纯化作用，但是该方法所得胶原蛋白纯度较低，不能有效分离Ⅲ型胶原、Ⅴ型胶原和其它一些杂质，更加不能有效分离部分降解或者断裂的胶原蛋白。本方法可通过凝胶色谱柱分离，使得不同分子量物质在不同时间出峰，使得完整三螺旋结构的Ⅰ型胶原蛋白、部分降解或断裂的Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白和其它杂质完全分离开，准确接收完整Ⅰ型胶原蛋白出峰流出液后，即可获得超纯高活性的Ⅰ型胶原蛋白。附图说明图1：为胶原蛋白AKTA系统纯化前色谱图；图2：为胶原蛋白AKTA系统纯化后色谱图。具体实施方式实施例11、原料处理：取出一定量的保存于-20℃的罗非鱼皮，用大量自来水浸泡并冲洗，去除鱼皮表面残留的鱼肉、鱼鳞等其他组织，用超纯水浸泡清洗3次。准确称取40g鱼皮，将鱼皮剪成1×1cm大小，于4℃冰柜中，在悬臂搅拌器不断搅拌的条件下，用500mL的10％正丁醇水溶液脱脂8h，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗20min，再用超纯水清洗3次。在4℃冰柜中，将上述脱脂后的鱼皮浸泡于500mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液中脱杂蛋白8h，期间用悬臂搅拌器搅拌，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗至中性，再用超纯水清洗3次；2、胶原提取：500mL的0.5mol/L醋酸溶液，再加入0.05g(原料鱼皮质量0.05％)无花果蛋白酶，于4℃冰柜中，用磁力搅拌器搅拌提取48h，然后于4℃，10000r/min条件下离心30min，收集上清液；3、提取物纯化：加入4g醋酸钠和5.8g氯化钠到酶解胶原液中，用酸或碱液调pH3-9，用过滤设备过0.22微米滤膜，用AKTA纯化系统进行纯化，同时使用凝胶分子筛柱，用样品接收器准确接收Ⅰ型胶原所出峰流出液。流出液加入无水乙醇溶液，直至所述胶原液中的乙醇含量达到40-60%，静置，过滤，得胶原蛋白，无水乙醇脱水，低温真空干燥得胶原蛋白粉末，即得医用级生物材料用天然高分子鱼皮胶原。实施例21、原料处理：取出一定量的保存于-20℃的鳕鱼鱼皮，用大量自来水浸泡并冲洗，去除鱼皮表面残留的鱼肉、鱼鳞等其他组织，用超纯水浸泡清洗3次。准确称取200g鱼皮，将鱼皮剪成0.5×2cm大小，于4℃冰柜中，在悬臂搅拌器不断搅拌的条件下，用2500mL的10％正丁醇水溶液脱脂8h，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗20min，再用超纯水清洗3次。在4℃冰柜中，将上述脱脂后的鱼皮浸泡于2500mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液中脱杂蛋白8h，期间用悬臂搅拌器搅拌，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗至中性，再用超纯水清洗3次；2、胶原提取：1500mL的0.3mol/L醋酸溶液，再加入0.5g(原料鱼皮质量0.05％)无花果蛋白酶，于4℃冰柜中，用磁力搅拌器搅拌提取48h，然后于4℃，10000r/min条件下离心30min，收集上清液；3、提取物纯化：加入20的醋酸钠和29g氯化钠到酶解胶原液中，用酸或碱液调pH3-9，用过滤设备过0.22微米滤膜，用AKTA纯化系统进行纯化，同时使用凝胶分子筛柱，用样品接收器准确接收Ⅰ型胶原所出峰流出液。流出液加入无水乙醇溶液，直至所述胶原液中的乙醇含量达到60-75%，静置，过滤，得胶原蛋白，无水乙醇脱水，低温真空干燥得胶原蛋白粉末，即得医用级生物材料用天然高分子鱼皮胶原。实施例2通过AKTA系统胶原蛋白纯化效果见附图1和附图2。附图1是胶原蛋白AKTA系统纯化前色谱图，有明显的杂峰。附图2是胶原蛋白AKTA系统纯化后色谱图，纯化后可见分布相对集中的单峰，I型胶原蛋白纯化效果明显。实施例1和实施例2的部分检测数据见下表，对照是采取常规盐析方法制备的胶原蛋白。项目实施例1实施例2对照水分11.5%11.8%12.6%色氨酸小于0.01%小于0.01%0.236%灰分0.26%0.18%1.12%羟脯氨酸含量10.08%10.25%8.86%脂质体0.15%0.13%0.45%pH值5.25.64.9纯度99.10%99.30%95.20%重金属含量4.1µg/g3.8µg/g8.2µg/g因为胶原蛋白不含有色氨酸，因此色氨酸含量通常也是代表了胶原蛋白的纯度，从数据可以看出，本专利技术方法制备的胶原蛋白色氨酸含量明显低于常规盐析法，纯度更高，灰分、脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种医用超纯高活性鱼皮胶原的制备方法，其特征在于，所述鱼皮胶原制备按照以下步骤进行：1）原料处理：将清洗干净并脱水后的罗非鱼皮绞碎成 0.5‑5cm 2 的小块后，加入料液比1:10‑25（w/w）的2‑15%正丁醇脱脂，0‑4℃搅拌8‑12小时后排除废液，并重复3‑4次，用去离子水清洗，将清洗后的鱼皮以料液比 1:10‑25（w/w）放入0.05‑ 0.2M的NaOH 溶液中搅拌32‑48小时，每间隔8‑12小时更换所述NaOH溶液一次，再用去离子水充分清洗经碱溶液处理后的鱼皮直至中性；2）胶原提取：将清洗后的鱼皮以料液比1:5‑20（w/w）的比例放入 0.05‑0.5M 的酸性溶液中，加入0.1%‑0.5% 的胃蛋白酶搅拌24‑60小时，酶解处理得酶解胶原液；3）提取物纯化：加入料液比1:50‑500（w/w）的醋酸钠和料液比1:50‑500（w/w）的氯化钠到酶解胶原液中，用酸或碱液调pH 3‑9，用过滤设备过0.22微米滤膜，用AKTA纯化系统进行纯化，同时使用凝胶分子筛柱，用样品接收器准确接收Ⅰ型胶原所出峰流出液，流出液加入无水乙醇溶液，直至所述胶原液中的乙醇含量达到40‑75%，静置，过滤，得胶原蛋白，无水乙醇脱水，低温真空干燥得胶原蛋白粉末。...
【技术特征摘要】
1.一种医用超纯高活性鱼皮胶原的制备方法，其特征在于，所述鱼皮胶原制备按照以下步骤进行：1）原料处理：将清洗干净并脱水后的罗非鱼皮绞碎成0.5-5cm2的小块后，加入料液比1:10-25（w/w）的2-15%正丁醇脱脂，0-4℃搅拌8-12小时后排除废液，并重复3-4次，用去离子水清洗，将清洗后的鱼皮以料液比1:10-25（w/w）放入0.05-0.2M的NaOH溶液中搅拌32-48小时，每间隔8-12小时更换所述NaOH溶液一次，再用去离子水充分清洗经碱溶液处理后的鱼皮直至中性；2）胶原提取：将清洗后的鱼皮以料液比1:5-20（w/w）的比例放入0.05-0.5M的酸性溶液中，加入0.1%-0.5%的胃蛋白酶搅拌24-60小时，酶解处理得酶解胶原液；3）提取物纯化：加入料液比1:50-500（w/w）的醋酸钠和料液比1:50-500（w/w）的氯化钠到酶解胶原液中，用酸或碱液调pH3-9，用过滤设备过0.22微米滤膜，用AKTA纯化系统进行纯化，同时使用凝胶分子筛柱，用样品接收器准确接收Ⅰ型胶原所出峰流出液，流出液加入无水乙醇溶液，直至所述胶原液中的乙醇含量达到40-75%，静置，过滤，得胶原蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨毅，潘涛，李乘风，
申请(专利权)人：青岛琛蓝海洋生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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