使用源自于人参的糖基转移酶使人参皂苷糖基化的新方法技术

本发明专利技术涉及对位于原人参二醇(PPD)或原人参三醇(PPT)型人参皂苷的C‑20位的羟基基团具有糖基化活性的尿苷二磷酸(UDP)‑糖基转移酶蛋白，和使用它来使UDP糖基化的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对位于原人参二醇(PPD)或原人参三醇(PPT)型人参皂苷的C-20位的羟基基团具有糖基化活性的尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶蛋白，和使用它来使UDP糖基化的方法。
技术介绍
人参是广泛用于改善健康的最受欢迎的药用植物之一。人参的根已经在传统医学中作为草药茶被食用，并且目前被用于各种产品，包括糖果、速溶茶和滋补性饮料。人参皂苷是人参中含有的糖基化三萜化合物，可以对健康提供许多积极的作用。特别地，人参皂苷已知具有各种药理学作用，例如增强免疫系统和复苏身体机能，并且已经从人参的根中鉴定了超过40种不同的人参皂苷。然而，难以大规模地生产单独的人参皂苷仍然是研究每种人参皂苷的功效——例如其对特定疾病的治疗效果和所鉴定的人参皂苷的商业用途——的主要障碍。人参皂苷是糖基化达玛烯型四环三萜，并且基于它们的糖苷配基结构可以分为三个不同的组：原人参二醇(PPD)型人参皂苷、原人参三醇(PPT)型人参皂苷和齐墩果酸型人参皂苷。基于通过糖苷键连接到化学结构中环的C-3、C-6和C-20位置的糖部分(糖苷配基)的位置和数目，这三个组可以进一步分类。PPD和PPT具有不同的羟基化模式。PPD在C-3、C-12和C-20位置具有-OH基团，而PPT在C-3、C-6、C-12和C-20位置具有-OH基团。PPD和PPT可以用葡萄糖或其它糖进行糖基化以转化成各种人参皂苷。糖基化PPD型人参皂苷包括人参皂苷Rb1、Rd、F2、Rg3、Rh2、化合物K(C-K)、Rb2、Rc、化合物MC(C-MC)、化合物Y(C-Y)等，并且糖基化PPT型人参皂苷包括人参皂苷Rg1、Rh1、F1、Rf、Re、Rg2等。人参皂苷的生物合成途径仅部分被鉴定。在IPP异构酶(IPI)、GPP合酶(GPS)、FPP合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)和鲨烯环氧酶(SE)的作用下，通过异戊烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸(DMADP)的一系列缩合反应合成氧化鲨烯之前，已知人参皂苷与其它三萜部分地共享生物合成途径(Ajikumar等人，Science，330，70-74，2010；Ro等人，Nature，440，940-943，2006；Sun等人，BMCGenomics，11，262，2010)。氧化鲨烯通过达玛烯二醇-II合酶(DS)环化成达玛烯二醇-II，该DS是三萜环化酶。达玛烯二醇-II在C-3和C-20位置具有羟基基团，并通过p450酶原人参二醇合酶(PPDS)将C-12位羟基化被转化为PPD。通过另一种p450蛋白将原人参三醇合酶(PPTS)的C-6位羟基化，PPDS也可以被转化为PPT。PPD可以通过在C-3和/或C-20位的糖基化被转化为各种PPD型人参皂苷，并且PPT可以通过在C-6和/或C-20位的糖基化被转化为各种PPT型人参皂苷。尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)是催化将糖部分从UDP-糖转移到多种多样的代谢物例如激素和次级代谢物的酶。一般来说，UGT在生物合成途径的最后步骤中起作用以便增加代谢物的溶解度、稳定性、储存性、生物活性或生物可用性。如植物代谢物的非凡的多样性所认可的，每个植物基因组具有数百种不同的UGT。例如，拟南芥(Arabidopsisthaliana)植物模型含有107个UGT，这些UGT基于氨基酸序列属于14个不同的组(组A-N)。然而，尽管DS、PPDS和PPTS已被报道为参与人参皂苷生物合成的酶，但是关于UGT是否参与人参皂苷生物合成知之甚少。因此，对于特定人参皂苷的生产，需要鉴定使用人参皂苷作为底物的UGT。不同的UGT对糖供体和糖受体都表现出底物特异性。例如，UGT78D2将葡萄糖从UDP-葡萄糖转移到黄酮醇(山奈酚或槲皮素)和花青素(矢车菊素)的C-3位，以便分别产生黄酮醇-3-O-葡萄糖苷和花青素-3-O-葡萄糖苷。似乎这种糖基化对于化合物的体内稳定性和储存是必不可少的。另一方面，UGT89C1将鼠李糖从UDP-鼠李糖转移到黄酮醇-3-O-葡萄糖苷的C-7位，以产生黄酮醇-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷。由于UGT89C1不利用UDP-葡萄糖和花青素-3-O-葡萄糖苷作为底物，已知UGT78D2对UDP-糖和其它受体表现出不同的特异性。如所描述的，因为不同的UGT可以具有不同的底物特异性和区域选择性，所以有必要研究单个UGT的底物特异性和区域选择性。
技术实现思路
技术问题本专利技术的专利技术人已经进行了大量的努力来开发具有底物特异性和区域选择性的新的UDP糖基转移酶，该UDP糖基转移酶可以被用于特定人参皂苷的生物合成。因此，他们已经鉴定了来自高丽参的新型糖基转移酶(PgUGT71A1)，并且发现PgUGT71A1可以将PPD型人参皂苷PPD、Rh2和Rg3分别转化为人参皂苷C-K、F2和Rd，并且可以将PPT转化为F1。由于该蛋白质对PPD和PPT型人参皂苷的C-20位的羟基基团具有糖基化活性，本专利技术的专利技术人已经证实其可用于生产特定的糖基化人参皂苷，并且已经完成了本专利技术。技术方案本专利技术的目的是提供制备在C-20位的羟基基团被糖基化的原人参二醇(PPD)或原人参三醇(PPT)型人参皂苷的方法，该方法包括将UDP糖基转移酶蛋白、引入了包含编码该蛋白的多核苷酸的载体或其片段并表现出该蛋白的活性的转化细胞、含有该转化细胞的生物体、或该转化细胞的培养物处理为在C-20位具有羟基基团的PPD或PPT型人参皂苷。本专利技术的另一个目的是提供用于制备在C-20位的羟基基团被糖基化的原人参二醇(PPD)或原人参三醇(PPT)型人参皂苷的组合物，其包含选自下组的一种或多种作为活性组分，该组由以下各项组成：尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶蛋白——其对在C-20位具有羟基基团的PPD或PPT型人参皂苷的C-20位的羟基基团具有糖基化活性、引入了包含编码该蛋白的多核苷酸的载体或其片段的转化细胞、含有该转化细胞的生物体、或该转化细胞的培养物。本专利技术的又另一个目的是提供由SEQIDNO:1的氨基酸序列所限定的UDP糖基转移酶蛋白，其对PPD或PPT型人参皂苷的C-20位羟基基团具有选择性糖基化活性。本专利技术的又另一个目的是提供编码该蛋白质的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体、含有该表达载体或其片段的转化细胞、和含有该转化细胞的生物体。本专利技术的又另一个目的是提供表达载体，该表达载体含有分别编码DS、tHMGR、PPDS和AtCPR蛋白的UDP糖基转移酶蛋白的多核苷酸；用于生产C-K的转化细胞，该转化细胞含有该表达载体或其片段；和含有该转化细胞的生物体。本专利技术的又另一个目的是提供表达载体，该表达载体含有分别编码DS、tHMGR、PPDS、AtCPR、和PPTS蛋白的UDP糖基转移酶蛋白的多核苷酸；用于生产F1的转化细胞，该转化细胞含有该表达载体或其片段；和含有该转化细胞的生物体。本专利技术的又另一个目的是提供表达载体，该表达载体含有分别编码DS、tHMGR、PPDS、AtCPR、和PgUGT74A1蛋白的UDP糖基转移酶蛋白的多核苷酸；用于生产F2的转化细胞，该转化细胞含有该表达载体或其片段；和含有该转化细胞的生物体。本专利技术的又另一个目的是提供表达载体，该表达载体含有分别编码DS、tHMGR、PPDS、AtCPR、PgUGT74本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备在C‑20位的羟基基团被糖基化的原人参二醇(PPD)或原人参三醇(PPT)型人参皂苷的方法，其包括：将尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶蛋白、引入了包含编码所述蛋白的多核苷酸的载体或其片段并表现出所述蛋白的活性的转化细胞、含有所述转化细胞的生物体、或所述转化细胞的培养物处理为在C‑20位具有羟基基团的PPD或PPT型人参皂苷。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.30 KR 10-2014-00527281.一种用于制备在C-20位的羟基基团被糖基化的原人参二醇(PPD)或原人参三醇(PPT)型人参皂苷的方法，其包括：将尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶蛋白、引入了包含编码所述蛋白的多核苷酸的载体或其片段并表现出所述蛋白的活性的转化细胞、含有所述转化细胞的生物体、或所述转化细胞的培养物处理为在C-20位具有羟基基团的PPD或PPT型人参皂苷。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述在C-20位具有羟基基团的PPD或PPT型人参皂苷选自下组的一种或多种，该组由以下各项组成：PPD、Rh2、Rg3、和PPT。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括一个或多个转化步骤，该转化步骤选自下组，该组由以下各项组成：PPD至化合物K(C-K)的转化、Rh2至F2的转化、Rg3至Rd的转化、以及PPT至F1的转化。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述UDP糖基转移酶蛋白由SEQIDNO:1的氨基酸序列所限定。5.一种用于制备在C-20位的羟基基团被糖基化的原人参二醇(PPD)或原人参三醇(PPT)型人参皂苷的组合物，该组合物包含选自下组的一种或多种作为活性组分，该组由以下各项组成：尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶蛋白——其对在C-20位具有羟基基团的PPD或PPT型人参皂苷的C-20位的羟基基团具有糖基化活性、引入了包含编码所述蛋白的多核苷酸的载体或其片段并表现出所述蛋白的活性的转化细胞、含有所述转化细胞的生物体、或所述转化细胞的培养物。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述在C-20位具有羟基基团的PPD或PPT型人参皂苷选自下组的一种或多种，该组由以下各项组成：PPD、Rh2、Rg3、和PPT。7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述UDP糖基转移酶蛋白将PPD转化为化合物K(C-K)、将Rh2转化为F2、将Rg3转化为Rd、或将PPT转化为F1。8.根据权利要求5所述的组合物，其中所述UDP糖基转移酶蛋白由SEQIDNO:1的氨基酸序列所限定。9.一种分离的尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶蛋白(PgUGT71A1)，其由SEQIDNO:1的氨基酸序列限定。10.根据权利要求9所述的尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶蛋白，其中所述蛋白对原人参二醇(PPD)或原...

【专利技术属性】
技术研发人员：金善昌，崔吉柱，郑硕采，朴明根，金佑炫，林修焕，林完泽，
申请(专利权)人：韩国科学技术院，智能合成生物中心，
类型：发明
国别省市：韩国;KR