一种五谷虫小分子多肽的分离方法技术

本发明专利技术属于中药材分离技术领域，具体涉及一种五谷虫小分子多肽的分离方法。本发明专利技术通过制备五谷虫小分子多肽冻干粉，配制母液，采用凝胶层析法分离，并对分离得到的洗脱液进行活性检测，最终分离得到具有抑菌活性的五谷虫小分子多肽。本发明专利技术分离方法操作简单、高效、快捷，稳定性、精密度、重现性比较好，为后续研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于中药材分离
，具体涉及一种五谷虫小分子多肽的分离方法。
技术介绍
中药五谷虫(maggot)别名谷虫、水仙子、罗仙子、蛆，为丽蝇科昆虫大头金蝇或其它近缘昆虫的幼虫或蛹壳。该虫性味咸、甘、寒，归经脾、胃，化学成分主要含蛋白质、溶菌酶、氨基酸、生物碱、油脂，有清热解毒、消积导滞的作用。在《纲目》中记载可用于治小儿诸疳积、疳疮，热病谵妄，毒痢作吐等疾病，此外医药书籍《本草求源》和《本草便读》对其药用价值也有记载。研究表明，一些外源物质或理化因素能诱导其产生更多的凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白等，从而五谷虫体中分离出的抗菌活性肽不仅具有抗菌、抗病毒作用，还可产生抗寄生虫、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用。王寿宇等发表了一篇题目为《中药五谷虫粗提物对感染创面抗菌活性的实验研究》的论文，该论文对五谷虫虫体进行匀浆并分离提纯，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用平板法对粗提物进行抗菌活性测定；SDS-PAGE分析纯化过程中蛋白质组成的差异。结果证明，五谷虫的抗菌成分为某种具有抗菌活性的小分子量蛋白肽类物质(中国中西医结合学会养生学与康复医学专业委员会委员会议暨第七次学术研讨会.2011:104-106.)。2013年，张振等在发表的论文《五谷虫抗金黄色葡萄球菌物质的纯化及抗菌机制》中提到应用超滤法对五谷虫粗提物进行纯化，用酶标浊度法及K-B纸片琼脂扩散法筛选出具有明显抗菌活性的滤出液，MTT法检测滤出液对金黄色葡萄球菌增殖的影响及测定最低抑菌浓度(MIC)，应用电镜技术观察抗菌物质作用后金黄色葡萄球菌的形态变化，实验结果证明，五谷虫滤出液抗菌物质能使金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性增加，使细菌细胞膜破裂，细胞内容物渗出。五谷虫抗菌物质相对分子质量小于10000，其可能通过作用于金黄色葡萄球菌细胞膜而形成孔洞，增加细胞膜通透性，而发挥抗菌作用(中国组织工程研究，2013(15):2755-2760)。目前，物质的分离技术有色谱技术(离子交换色谱、疏水作用色谱、薄层色谱、RP-HPLC技术等)、层析技术(金属离子亲和技术、免疫亲和层析技术、灌注层析等)、电泳技术(毛细管区带电泳技术、毛细管凝胶电泳等)和纳滤技术等。五谷虫体内的成分复杂多样，提取得率低，迄今为止未见中药五谷虫小分子多肽分离方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术所存在的技术问题，提供一种快速、高效、便捷的五谷虫小分子多肽的分离方法，为活性单体的制备及其药用价值的研究提供依据。本专利技术是通过如下技术方案实现的：A.将新鲜五谷虫加水匀浆、过滤、超声破碎、离心过滤、水浴加热、离心取上清液、超滤、冷冻干燥，得五谷虫小分子多肽冻干粉；B.向上述步骤A得到的五谷虫小分子多肽冻干粉中加入超纯水，配制成浓度为0.2-0.6g/ml，超声溶解，经水相滤膜过滤，得母液；C.将上述步骤B得到的母液采用凝胶层析法分离，在254nm检测波长下，收集小于10KD的S1峰，S2峰和S3峰的洗脱液，多次洗脱下来的峰液分别合并，真空冷冻干燥得冻干粉；D.将上述步骤C收集到的小于10KD的S1峰，S2峰和S3峰的洗脱液冻干粉进行菌种活性检测，得S2峰和S3峰洗脱液小肽。其中，所述步骤A中的加入单蒸水匀浆，单蒸水的加入量是新鲜五谷虫重量的2-4倍；其中，所述步骤A中超声破碎条件为：超声粉碎30-50s，重复4-6次，强度14-16kHz，600-800W；其中，所述步骤A中水浴温度为90℃-100℃；离心温度为4℃，10000-12000r/min离心20-30min；其中，所述步骤A中超滤方法为：将上清液先过分子截留量为100KD的超滤膜，滤液再过分子截留量为30KD的超滤膜，得分子量为30KD以下的滤液。其中，所述步骤B中的水相滤膜孔径为0.22μm。其中，所述步骤C中凝胶层析法，分离条件如下：SuperdexTM30凝胶柱大小16mm×600mm，流动相：超纯水，流速：1.0ml/min，进样量：1ml，柱压：0.30Pa，检测波长254nm，柱温23-27℃。本专利技术与现有技术相比，有如下有益效果：(1)本专利技术成功构建了一种中药五谷虫小分子多肽的分离方法，在分离过程中运用超滤膜对分子量进行分级，避免大分子量多肽的干扰，节省时间，提高分离纯化的效率。(2)本专利技术公开的中药五谷虫小分子多肽的分离方法操作简单高效快捷，稳定性、精密度、重现性比较好，为后续研究奠定了基础。附图说明图1为实施例1的五谷虫小分子多肽的分离方法的SuperdexTM30凝胶过滤层析法分离结果图；图2为实施例1的五谷虫小分子多肽的分离方法收集的S2峰洗脱液的RP-HPLC法纯化的色谱图；图3为实施例1的五谷虫小分子多肽的分离方法收集的S3峰洗脱液的RP-HPLC法纯化的色谱图；图4为S2峰的峰5洗脱液RP-HPLC法纯化的色谱图；图5为S2峰的峰6洗脱液RP-HPLC法纯化的色谱图；图6为S3峰的峰2的洗脱液RP-HPLC法纯化的色谱图；图7为S3峰的峰3的洗脱液RP-HPLC法纯化的色谱图。具体实施方式本专利技术主要使用蛋白层析仪(AKTATMpμrifier,美国GE公司)，高效液相色谱仪(Waters-2695，美国Waters公司)；真空冷冻冻干仪(美国LABCONCO公司)；超滤离心管(广州文睿科学仪器有限公司)；立式高速冷冻离心机(uNIVERSAL32R，德国Hettich公司)等；其他试剂为色谱纯或分析纯。实施例1A.五谷虫小分子多肽冻干粉的制备方法：1)匀浆：取新鲜冷冻的五谷虫解冻称重，加入五谷虫3倍重量体积的单蒸水于高速组织匀浆机中匀浆，匀浆液用200目的纱网过滤，得滤液；2)超声破碎：将滤液超声粉碎40s，重复5次，强度14kHz，800W；3)离心过滤：将超声处理后的样品4℃，12000rpm/min离心25min，取上清液，用脱脂棉过滤除去最上层的脂肪，重复此步骤两次，得滤液；4)水浴加热：将滤液在90℃水浴锅中边加热边搅拌12min以去除大分子蛋白；5)离心取上清：滤液水浴加热后，在冰水中冷却10min，4℃，12000rpm/min离心25min，取上清；6)超滤：将上清液先过分子截留量为100KD的超滤膜，滤液再过分子截留量为30KD的超滤膜，得分子量为30KD以下的滤液；7)冷冻干燥：将滤液在-80℃冰冻3h后，进行冷冻干燥，得五谷虫小分子多肽冻干粉。B.上样母液的制备：精密称定五谷虫小分子多肽冻干粉，超纯水溶解，浓度为0.4g/mL，0.22μm的水相滤膜过滤，准备上样。C.SuperdexTM30凝胶过滤层析法初步分离：1)SuperdexTM30装柱：溶胀：缓慢的将SuperdexTM30凝胶填料放入盛有双蒸水的干净烧杯中，室温浸泡12h-24h。漂洗：用双蒸水漂洗以去除细小颗粒，静置数小时后更换双蒸水，重复3次。装柱：将溶胀漂洗好的填料用超声去气泡的双蒸水混悬，柱子上端接好装柱器，玻璃棒引流，倒入垂直固定在铁架台上的层析柱内，同时让水从柱子下端流出，使颗粒自然均匀的沉降，注意不能有气泡和分段。压实：数小时后连接好柱子上端，超声去气泡并且超滤过的超纯水为流动相，以5ml/min的流速压实柱子。2)柱平衡：用流动相以1ml/min的流速平衡Super本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种五谷虫小分子多肽的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：A.将新鲜五谷虫加水匀浆、过滤、超声破碎、离心过滤、水浴加热、离心取上清液、超滤、冷冻干燥，得五谷虫小分子多肽冻干粉；B.向上述步骤A得到的五谷虫小分子多肽冻干粉中加入超纯水，配制成浓度为0.2‑0.6g/ml，超声波溶解，经水相滤膜过滤，得母液；C.将上述步骤B得到的母液采用凝胶层析法分离，在254nm检测波长下，收集小于10KD的S1峰，S2峰和S3峰的洗脱液，多次洗脱下来的峰液分别合并，真空冷冻干燥得冻干粉；D.将上述步骤C收集到的小于10KD的S1峰，S2峰和S3峰的洗脱液冻干粉进行菌种活性检测，得S2峰和S3峰洗脱液小肽。

【技术特征摘要】
1.一种五谷虫小分子多肽的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：A.将新鲜五谷虫加水匀浆、过滤、超声破碎、离心过滤、水浴加热、离心取上清液、超滤、冷冻干燥，得五谷虫小分子多肽冻干粉；B.向上述步骤A得到的五谷虫小分子多肽冻干粉中加入超纯水，配制成浓度为0.2-0.6g/ml，超声波溶解，经水相滤膜过滤，得母液；C.将上述步骤B得到的母液采用凝胶层析法分离，在254nm检测波长下，收集小于10KD的S1峰，S2峰和S3峰的洗脱液，多次洗脱下来的峰液分别合并，真空冷冻干燥得冻干粉；D.将上述步骤C收集到的小于10KD的S1峰，S2峰和S3峰的洗脱液冻干粉进行菌种活性检测，得S2峰和S3峰洗脱液小肽。2.根据权利要求1所述的五谷虫小分子多肽的分离方法，其特征在于，所述步骤A中的加入单蒸水匀浆，单蒸水的加入量是新鲜五谷虫重量的2-4倍。3.根据权利要求1所述的五谷虫小分子多肽的分离方法，其特征在于，所述步骤A中超声破碎条件为：超声粉碎30-50s，重复4-6次，强度...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱家勇，王敏，褚夫江，金小宝，刘文彬，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44