重组单纯疱疹病毒HSV‑hTERTp_ICP4_Hep‑GFP及其对应的诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种重组单纯疱疹病毒HSV‑hTERTp_ICP4_Hep‑GFP及其对应的诊断试剂盒；所述病毒的基因组上的端粒酶逆转录酶启动子和ICP4基因之间插入长度为25bp的DNA片段，且ICP34.5位点插入了GFP表达盒，其中，DNA片段序列为TTGCCCCAAGCGGCATTTGGGTTCA。该病毒具有选择性地高滴度繁殖力，病毒在肝癌细胞繁殖滴度稳定在106以上。本发明专利技术用合成的随机核苷酸短序列与HSV1‑hTERTp_ICP4病毒基因组进行定点重组(在hTERTp与ICP4之间)。短序列的改变不但可以增加病毒的繁殖滴度，还可以使不同病毒针对不同类型肿瘤细胞产生选择性地高滴度繁殖。如有的病毒在肝癌细胞繁殖较好，有的病毒则在肝癌细胞产生更高的滴度等等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组单纯疱疹病毒，具体地指一种重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP及其对应的诊断试剂盒。
技术介绍
端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，其作用是维护染色体结构稳定，包括防止染色体末端融合，保护染色体结构基因和避免遗传信息在复制中丢失。端粒酶是由小分子RNA和蛋白质组成的逆转录酶,能利用自身RNA为模板合成端粒DNA,弥补随细胞有丝分裂逐渐缩短的端粒。其有三个主要组成部分：人端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)、端粒酶相关蛋白(telomerase-associatedprotein,TP1/TLP1)、人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)。端粒酶RNA在大多数细胞中都表达,而人端粒酶逆转录酶是端粒酶的限速成分，仅在端粒酶阳性的细胞中表达，与端粒酶活性相关。尽管一些肿瘤细胞在重组时通过替代性端粒延长(alternativelengtheningoftelomeres,ALT)机制来维持端粒长度,但仍有90％以上的肿瘤细胞通过上调hTERT来活化端粒酶，而且hTERT仅在极少数正常体细胞中表达。现已知端粒酶启动子(hTERTp)仅在端粒酶活性高的细胞中启动转录过程，这就为肿瘤靶向治疗提供了一个很好的契机。单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus，HSV)表达的感染细胞蛋白(infectedcellproteins,ICPs)分为三个等级：初始(immediateearly,IE)、早期(early)和晚期(late)。其中IE蛋白是影响病毒复制的关键蛋白，包括：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，而其中ICP4是最关键的复制相关蛋白。如果将ICP4基因的固有启动子置换成hTERTp，就有可能使HSV选择性地在肿瘤细胞内繁殖。人工合成人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)以替换实验室现有I型溶瘤单纯疱疹病毒(17+毒株)基因组中ICP4原启动子，构建出一种新型病毒HSV-hTERTp_ICP4。该重组病毒能选择性地在人肿瘤细胞内生长繁殖，而不在人的正常细胞中繁殖。构建含hTERTp_ICP4表达盒的质粒是构建的HSV-hTERTp_ICP4病毒的基础，用含hTERTp_ICP4表达盒的质粒，我们构建了原始的HSV-hTERTp_ICP4，该重组病毒虽然可以选择性地在肿瘤细胞内繁殖，但繁殖滴度较低(104/ml)。为了解决繁殖滴度较低的缺陷，迫切需要构建一种繁殖滴度较高的病毒。
技术实现思路
本专利技术所要解决现有病毒繁殖滴度较低的缺陷，提供了一种重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP，该病毒具有选择性地高滴度繁殖力，病毒在肝癌细胞繁殖滴度稳定在106以上。本专利技术还提供了一种由重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP制备得到的诊断试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供的一种重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP，所述病毒的基因组上的端粒酶逆转录酶启动子和ICP4基因之间插入长度为25bp的DNA片段，且ICP34.5位点插入了GFP表达盒，其中，DNA片段序列为TTGCCCCAAGCGGCATTTGGGTTCA。一种重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP的制备方法，包括以下步骤：1)用人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp取代含有ICP4基因的单纯疱疹病毒中的ICP4基因启动子，构建该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：(1)构建穿梭质粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFPa.用BHK细胞培养含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并纯化其基因组DNA；b.扩增ICP4基因上游侧翼序列：以步骤a)中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：ICP4USf正向引物：ccctccagacgcaccggagtcggggg，ICP4USr反向引物：aagtcgactctagaggatcgatctctgacctgagattggcggcactgaggta扩增出ICP4基因上游侧翼序列；c.扩增ICP4基因下游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物：ICP4DSf正向引物：aaaagtcgacctgcaggcatgctaacgaggaacgggcagggggcICP4DSr反向引物：aaaaaagcttgcatgcccacgtgcgcggggccagacgggct扩增出ICP4基因下游侧翼序列；将上下游侧翼序列克隆到pSP73质粒上，构建pICP4del及pICP4del-eGFP质粒：将SalI酶切的前述扩增出的ICP4基因的上游侧翼序列及SalI/HindIII双酶切的前述扩增出的ICP4基因的下游侧翼序列混合并连接到pSP73的EcoRV/HindIII位点，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP切下CMV启动子控制的eGFP表达盒，经T4DNA聚合酶补平末端后插入到pICP4del的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP；d.分三次PCR扩增出ICP4基因中三段序列：首先，使用以下引物：ICP4-1st正向引物：ttttttgaattcatggcgtcggagaacaagcagcgccICP4-1st反向引物：tggagccaccccatggcctccgcgtICP4-2nd正向引物：cgacgccgcgcagcagtacgccctgICP4-2nd反向引物：cggcgggggcgggcccggcgcaccgICP4-3rd正向引物：cctcatgtttgacccgcgggccctgICP4-3rd反向引物：ttttttctcgagttacagcaccccgtccccctcgaac以步骤a)中所得病毒基因组DNA为模板，分别扩增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分别将该三段基因片段插入pSP73质粒的EcoRV位点构建出以下三种质粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd，从该三种质粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；e.从含人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的质粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代从pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV启动子，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位点插入NheI-HapI-NheI酶切位点序列所得；f.将步骤c)中得到的ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并连接到步骤d)得到的pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；g.用SalI酶切步骤b)得到的含ICP4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组单纯疱疹病毒HSV‑hTERTp_ICP4_Hep‑GFP，其特征在于：所述病毒的基因组上的端粒酶逆转录酶启动子和ICP4基因之间插入长度为25bp的DNA片段，且ICP34.5位点插入了GFP表达盒，其中，DNA片段序列为TTGCCCCAAGCGGCATTTGGGTTCA。

【技术特征摘要】
1.一种重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP，其特征在于：所述病毒的基因组上的端粒酶逆转录酶启动子和ICP4基因之间插入长度为25bp的DNA片段，且ICP34.5位点插入了GFP表达盒，其中，DNA片段序列为TTGCCCCAAGCGGCATTTGGGTTCA。2.一种权利要求1所述重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)用人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp取代含有ICP4基因的单纯疱疹病毒中的ICP4基因启动子，构建该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：(1)构建穿梭质粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFPa.用BHK细胞培养含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并纯化其基因组DNA；b.扩增ICP4基因上游侧翼序列：以步骤a)中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：ICP4USf正向引物：ccctccagacgcaccggagtcggggg，ICP4USr反向引物：aagtcgactctagaggatcgatctctgacctgagattggcggcactgaggta扩增出ICP4基因上游侧翼序列；c.扩增ICP4基因下游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物：ICP4DSf正向引物：aaaagtcgacctgcaggcatgctaacgaggaacgggcagggggcICP4DSr反向引物：aaaaaagcttgcatgcccacgtgcgcggggccagacgggct扩增出ICP4基因下游侧翼序列；将上下游侧翼序列克隆到pSP73质粒上，构建pICP4del及pICP4del-eGFP质粒：将SalI酶切的前述扩增出的ICP4基因的上游侧翼序列及SalI/HindIII双酶切的前述扩增出的ICP4基因的下游侧翼序列混合并连接到pSP73的EcoRV/HindIII位点，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP切下CMV启动子控制的eGFP表达盒，经T4DNA聚合酶补平末端后插入到pICP4del的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP；d.分三次PCR扩增出ICP4基因中三段序列：首先，使用以下引物：ICP4-1st正向引物：ttttttgaattcatggcgtcggagaacaagcagcgccICP4-1st反向引物：tggagccaccccatggcctccgcgtICP4-2nd正向引物：cgacgccgcgcagcagtacgccctgICP4-2nd反向引物：cggcgggggcgggcccggcgcaccgICP4-3rd正向引物：cctcatgtttgacccgcgggccctgICP4-3rd反向引物：ttttttctcgagttacagcaccccgtccccctcgaac以步骤a)中所得病毒基因组DNA为模板，分别扩增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分别将该三段基因片段插入pSP73质粒的EcoRV位点构建出以下三种质粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd，从该三种质粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；e.从含人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的质粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代从pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV启动子，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位点插入NheI-HapI-NheI酶切位点序列所得；f.将步骤c)中得到的ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并连接到步骤d)得到的pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；g.用SalI酶切步骤b)得到的含ICP4基因上下游侧翼序列的质粒pICP4del，并补平末端待用，用PmeI和HpaI从步骤e)得到的质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表达盒片段，并将其与该酶切后待用的pICP4del质粒连接，构建出质粒pICP4del-hTERTp_ICP4；h.构建BHK-ICP4辅助细胞：用EcoRI和XhoI从步骤e)质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV启动子的下游EcoRI和XhoI位点，得到pcDNA3-CMV-ICP4质粒；将该pcDNA3-CMV-ICP4质粒转染BHK细胞，该pcDNA3-CMV-ICP4质粒DNA可重组到BHK细胞基因组中，使有些BHK重组细胞获得对新霉素的抗性和表达ICP4，用抗菌素G418杀死未重组的BHK细胞，经过几轮的亚克隆筛选，用RT-PCR方法筛选出表达ICP4的BHK-ICP4辅助细胞；(2)剔除基因组中ICP4基因启动子并插入端粒酶逆转录酶启动子hTERTp启动子：a.用BHK细胞培养该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并提取病毒基因组DNA；b.将步骤A中该病毒基因组DNA与步骤1)的b)小步骤得到的质粒pICP4del-eGFP共转入步骤1)的g)小步骤得到的BHK-ICP4辅助细胞内，经同源重组，该质粒pICP4del-eGFP中绿色荧光蛋白GFP表达盒置换了该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒HSV的ICP4基因，使得重组病毒的毒斑发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷明，张婧，
申请(专利权)人：重庆宇珩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50