本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了盐生植物沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI及其植物表达载体和应用。沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI，该基因的序列为SEQ ID NO. 1。所述的植物表达载体为BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切ZmPDI后插入到gateway入门载体pENTR1A后与pEarleyGate103表达载体质粒进行重组反应得到。本发明专利技术提供的沟叶结缕草ZmPDI是一个新的耐盐基因，该基因可提高植物耐盐性，可在创造耐盐新种质、植物品种改良中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及盐生植物沟叶结缕草中一个新的耐盐基因ZmUBP及其植物表达载体和应用。
技术介绍
土壤盐渍化已经成为影响植物生长发育及产量的关键胁迫因子，耐盐植物的培育利用是解决盐胁迫下植物生长的最有利途径。随着分子生物学技术的不断完善，通过基因工程手段结合分子设计理念来提高植物抗逆性已成为目前研究的热点方向，由此，挖掘耐盐基因并加以利用显得至关重要。FOX捕捉系统通过在模式植物拟南芥中过量表达目标植物全长cDNA文库，获得含有不同cDNA插入的转基因拟南芥库，根据这些表达的全长cDNA导致的显著突变表型，获得目标植物的cDNA基因功能(Ichikawaetal.2006)。本课题组将FOX捕捉系统应用在盐生植物沟叶结缕草中，发现了一个耐盐性显著增强的拟南芥表型，通过测序验证获得了一个沟叶结缕草耐盐候选基因ZmUBP，通过生物信息学分析，ZmUBP编码一个包含U-box结构域蛋白，分别与水稻中的OsUBP39（XP_015651212）和拟南芥中的AtUBP38（AT5G65200）的同源性达到70.52%和32.5%，然而OsUBP39和AtUBP38的耐盐功能尚无报道。由此，我们获得的ZmUBP是一个新的耐盐候选基因。本专利技术的动因就是：将沟叶结缕草ZmUBP构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，获得具有耐盐特性的新种质。本专利对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。
技术实现思路
针对
技术介绍
提出的培育耐盐新种质的问题，本专利技术的目的在于提供一个新的盐生植物沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP。本专利技术的另一目的在于该耐盐基因ZmUBP的植物表达载体。本专利技术所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，创制耐盐新种质，可用于植物品种改良。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP，该基因的序列为SEQIDNO.1；含有本专利技术所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP的植物表达载体，由所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP与植物表达载体构成；所述的含有沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP的植物表达载体，优选为BamHⅠ和NotI双酶切ZmUBP后插入到gateway入门载体pENTR1A后与pEarleyGate103表达载体质粒进行重组反应得到。本专利技术所述的含有沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP的植物表达载体的构建方法，包括如下步骤。（1）ZmUBP基因全长的克隆：设计引物ZmUBP-F:SEQIDNO.2和ZmUBP-R:SEQIDNO.3，以沟叶结缕草cDNA为模板，进行PCR反应，PCR产物连接到pMD19-TSimple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒并测序获得基因全长序列为SEQIDNO.1。（2）pENTR1A-ZmUBP质粒构建：设计引物ZmUBP-BamHⅠ-F:SEQIDNO.4和ZmUBP-NotⅠ-R:SEQIDNO.5，以步骤（1）中的阳性测序质粒为模板，用高保真酶进行PCR反应，获得在上游和下游分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点的ZmUBP基因，PCR产物连接到pMD19-TSimple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-TSimple-ZmUBP；BamHⅠ和NotⅠ分别对阳性质粒pMD19-TSimple-ZmUBP和pENTR1A进行双酶切，取酶切后的ZmUBP片段与BamHⅠ和NotⅠ双酶切的pENTR1A连接，连接产物转化TOP10感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pENTR1A-ZmUBP。（3）提取的阳性质粒pENTR1A-ZmUBP经PvuⅠ单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQIDNO.1，植物表达载体pEarleyGate103-ZmUBP构建成功。本专利技术所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP在创建耐盐新种质中的应用。本专利技术所述的植物表达载体在创建耐盐新种质中的应用。本专利技术的有益效果：1．本专利技术提供的沟叶结缕草ZmUBP是一个新的耐盐基因，该基因可提高植物耐盐性；2．本专利技术构建的沟叶结缕草ZmUBP植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐盐新种质，提高植物的耐盐性，可进行植物品种改良。附图说明图1ZmUBP琼脂糖凝胶电泳分析M：DNAMarker1：ZmUBP；2：pMD19-TSimple-ZmUBP质粒BamH和NotI双酶切3：pEarleyGate103-ZmUBP表达载体电泳检测图图2植物表达载体pEarleyGate103-ZmUBP构建流程图图3野生型（WT）与转基因拟南芥（ZmUBP）PCR鉴定图4野生型与转基因拟南芥耐盐性评价具体实施方式实施例1沟叶结缕草ZmUBP的克隆（图1）。选用沟叶结缕草（Zoysiamatrella）作为材料，选取健康的草皮块，置于装满石英砂的杯中，于1/2Hongland营养液水培20天后，转入到含300mMNaCl的1/2Hongland营养液中处理7d，取0.1g幼嫩叶片，参照TrizolRNA提取试剂盒（TaKaRa）说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒（TaKaRa）取1µg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，设计引物扩增ZmUBP；上游引物ZmUBP-F:5′-ATGCCAAAGGACAGGAGC-3′（SEQIDNO.2）；下游引物ZmUBP-R:5′-TTGTGCAGGGTCACCGTC-3′（SEQIDNO.3）。以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应，20μL反应体系：2×LARCRMix10µL，ZmUBP-F、ZmUBP-R引物各1.0µL（10µmol·L-1），cDNA模板1µL，ddH2O7µL；反应程序：95℃预变性3min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，反应30个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收纯化，用T4DNA连接酶（TaKaRa）连接到pMD19-TSimple载体（TaKaRa），转化TOP10感受态细胞，提取质粒并测序为SEQIDNO.1。实施例2.植物表达载体pEarleyGate103-ZmUBP的构建（图1，图2）。设计引物进行PCR反应，在目的基因ZmUBP的上游和下游分别引入酶切位点BamHⅠ和NotⅠ，PCR产物连接到pMD19-TSimple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，BamHⅠ和NotⅠ双酶切的ZmUBP片段与BamHⅠ和NotⅠ双酶切的pENTR1A连接，转化大肠杆菌，提取的阳性质粒经NsiⅠ单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应（Invitrogen），转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQIDNO.1；上游引物ZmUBP-BamHⅠ-F：5′-GGATCCGGATGCCAAAGGACAGGAGC-3′（SEQIDNO.4）；下游引物ZmUBP-NotⅠ-R：5′-GCGGCCGCGATTGTGCAGGGTCACCGTC-3′（SEQIDNO.5）。①以实本文档来自技高网...
【技术保护点】
沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP，其特征在于该基因的序列为SEQ ID NO. 1。
【技术特征摘要】
1.沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP，其特征在于该基因的序列为SEQIDNO.1。2.含有权利要求1所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP的植物表达载体，其特征在于由权利要求1所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP与植物表达载体构成。3.根据权利要求2所述的含有权利要求1所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP的植物表达载体，其特征在于所述的植物表达载体为BamHⅠ和NotⅠ双酶切ZmUBP后插入到gateway入门载体pENTR1A，经线性化后与pEarleyGate103表达载体质粒进行重组反应得到。4.权利要求3所述的沟含有权利要求1所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmUBP的植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：（1）ZmUBP基因全长编码区的获得：设计引物ZmUBP-F:SEQIDNO.2和ZmUBP-R:SEQIDNO.3，以沟叶结缕草cDNA为模板进行PCR反应，PCR产物连接到pMD19-TSimple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒并测序获得ZmUBP全长序列SEQIDNO.1；（2）pENTR1A-ZmUBP质粒构建：设计引物Zm...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈煜，宗俊勤，陈静波，刘建秀，李建建，汪毅，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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