改良型腈水合酶制造技术

本发明专利技术涉及提高了高温下的酰胺化合物耐性的新型改良型腈水合酶。具体而言，涉及在序列号50所示的氨基酸序列中具有选自下述(a)～(d)中的至少一个氨基酸变异的腈水合酶(X1～X27表示独立的任意的氨基酸残基)。(a)X1为缬氨酸或甘氨酸；(b)X9为缬氨酸或苏氨酸；(c)X23为选自由异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸组成的组中的氨基酸；(d)X24为亮氨酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及改良型(变异型)腈水合酶及其制造方法。进而涉及编码该酶的DNA、包含该DNA的重组载体、和具有该重组载体的转化体以及酰胺化合物的制造方法。
技术介绍
腈水合酶是具有使腈基水合而转化为酰胺基的腈水合活性的酶。使用该酶或含有该酶的微生物菌体等来进行与腈化合物对应的酰胺化合物的制造，已知该方法与现有的化学合成法相比，自腈化合物向对应的酰胺化合物的转化率和选择率高。作为生产腈水合酶的微生物，例如可列举出属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1株用于丙烯酰胺的工业生产中，其有用性已被证实。另外，编码该菌株所产生的腈水合酶的基因也已明确(参照专利文献1)。另一方面，不仅利用由自然界中存在的微生物分离的腈水合酶、其基因，还出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、对底物的稳定性、对产物的稳定性等目的，尝试了向腈水合酶中导入变异；嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶中，由立体结构信息预测与底物特异性、热稳定性相关的区域，从中取得底物特异性变化了的变异酶(参照专利文献2～4)。另外，本专利技术人等得到耐热性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(参照专利文献5～9)。但是，从催化剂成本等生产成本的观点等出发，进一步提高耐热性和酰胺化合物耐性、或开发能在高温下反应的腈水合酶而用于酰胺化合物的制造是非常有用的，从反应时的酶量的削减和成本削减等观点出发，期望获得具有这种性能的酶。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第3162091号公报专利文献2：国际公开第2004/056990号小册子专利文献3：日本特开2004-194588号公报专利文献4：日本特开2005-16403号公报专利文献5：国际公开第2005/116206号小册子专利文献6：日本特开2007-143409号公报专利文献7：日本特开2007-43910号公报专利文献8：日本特开2008-253182号公报专利文献9：日本特开2010-172295号公报
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的在于提供提高了高温下的酰胺化合物耐性的新型改良型腈水合酶，使制造效率更高的酰胺化合物的制造方法成为可能。用于解决问题的方案本专利技术人等为了解决上述问题进行了深入的研究，发现在腈水合酶的氨基酸序列中将特定的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基而成的蛋白质不仅具有腈水合酶活性，而且提高了高温下的酰胺化合物耐性，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供以下的[1]～[13]。[1]一种改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E(其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为除酪氨酸之外的氨基酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC(其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为除丝氨酸之外的氨基酸，X10～X22彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；(c)序列号48：X23WDSX25X26EX27RX28X29V(其中，W表示色氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸、R表示精氨酸，V表示缬氨酸，X23表示除缬氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；(d)序列号49：VX24DSX25X26EX27RX28X29V(其中，V表示缬氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，X24表示除色氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)[2]根据上述[1]所述的改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E(其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为除酪氨酸之外的氨基酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC(其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为除丝氨酸之外的氨基酸，X10～X20彼此独立地表示任意的氨基酸残基，X21表示缬氨酸，X22表示苏氨酸)；(c)序列号48：X23WDSX25X26EX27RX28X29V(其中，W表示色氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，V表示缬氨酸，X23表示除缬氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；(d)序列号49：VX24DSX25X26EX27RX28X29V(其中，V表示缬氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，X24表示除色氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)[3]根据上述[1]所述的改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E(其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为甘氨酸或缬氨酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC(其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为缬氨酸或苏氨酸，X10～X20彼此独立地表示任意的氨基酸残基，X21表示缬氨酸，X22表示苏氨酸)；(c)序列号48：X23WDSX25X26EX27RX28X29V(其中，W表示色氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，V表示缬氨酸，X23选自由异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸和苏氨酸组成的组，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；(d)序列号49：VX24DSX25X26EX27RX28X29V(其中，V表示缬氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，X24表示亮氨酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的改良型腈水合酶，其中，前述序列号46中，X2为T(苏氨酸)、X3为E(谷氨酸)、X4为Y(酪氨酸)、X5为E(谷氨酸)、X6为A(丙氨酸)、X7为T(苏氨酸)、X8为I(异亮氨酸)，前述序列号47中，X10为A(丙氨酸)、X11为V(缬氨酸)、X12为F(苯丙氨酸)、X13为D(天冬氨酸)、X14为S(丝氨酸)、X15为Q(谷氨酰胺)、X16为T(苏氨酸)、X17为H(组氨酸)、X18为H(组氨酸)、X19为V(缬氨酸)、X20为V(缬氨酸)，前述序列号48和49中，X25为S(丝氨酸)、X26为S(丝氨酸)、X27为I(异亮氨酸)、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为除酪氨酸之外的氨基酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基；(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为除丝氨酸之外的氨基酸，X10～X22彼此独立地表示任意的氨基酸残基；(c)序列号48：X23WDSX25X26EX27RX28X29V其中，W表示色氨酸、D表示天冬氨酸、S表示丝氨酸、E表示谷氨酸、R表示精氨酸、V表示缬氨酸、X23表示除缬氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；(d)序列号49：VX24DSX25X26EX27RX28X29V其中，V表示缬氨酸、D表示天冬氨酸、S表示丝氨酸、E表示谷氨酸、R表示精氨酸、X24表示除色氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.06 JP 2014-1180411.一种改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为除酪氨酸之外的氨基酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基；(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为除丝氨酸之外的氨基酸，X10～X22彼此独立地表示任意的氨基酸残基；(c)序列号48：X23WDSX25X26EX27RX28X29V其中，W表示色氨酸、D表示天冬氨酸、S表示丝氨酸、E表示谷氨酸、R表示精氨酸、V表示缬氨酸、X23表示除缬氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；(d)序列号49：VX24DSX25X26EX27RX28X29V其中，V表示缬氨酸、D表示天冬氨酸、S表示丝氨酸、E表示谷氨酸、R表示精氨酸、X24表示除色氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为除酪氨酸之外的氨基酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基；(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为除丝氨酸之外的氨基酸，X10～X20彼此独立地表示任意的氨基酸残基，X21表示缬氨酸，X22表示苏氨酸；(c)序列号48：X23WDSX25X26EX27RX28X29V其中，W表示色氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，V表示缬氨酸，X23表示除缬氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基；(d)序列号49：VX24DSX25X26EX27RX28X29V其中，V表示缬氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，X24表示除色氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基。3.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为甘氨酸或缬氨酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基；(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为缬氨酸或苏氨酸，X10～X2...

【专利技术属性】
技术研发人员：北原彩，秋山卓理，若松美纪，渡边文昭，
申请(专利权)人：三菱丽阳株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP