TNF α的结合成员制造技术

本发明专利技术涉及抗‑TNF α结合成员并特别涉及高度稳定和可溶的单价、高效TNF α‑结合抗体片段。此类结合成员可用于治疗炎性疾病和其它疾病以及用于诊断学。还提供了相关的核酸、载体、细胞和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求在2014年3月26号提交欧洲专利局的欧洲专利申请EP14001123的权益和优先权。欧洲专利申请EP14001123的内容通过引用用于所有目的以其全部并入本文，包括所有的表、图和权利要求-以及包括并入本文不含有并依照PCT的规则4.18、在PCT的规则20.5(a)中提及的说明书、权利要求书或附图的任何元素或部分。参考序列表本申请包括序列表。专利
提供了针对TNFα的结合成员，例如人源化结合分子，特别是单价、高度有效且稳定的抗-TNFα试剂，例如抗体片段，其适用于治疗和诊断用途。在一些实施方式中，所述结合成员是免疫球蛋白、其片段、或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子，其对于TNFα是特异性的。还提供了编码此类结合成员的核酸分子、含有各自的核酸分子的序列的载体、含有所述载体或各自的核酸分子的核酸序列的宿主细胞、含有所述结合成员或所述核酸分子的药物组合物和诊断组合物，及其用途。背景本专利技术的以下背景讨论仅提供用于帮助读者理解本专利技术并且不承认用于描述或构成本专利技术的现有技术。肿瘤坏死因子(TNF)α是有效的促炎细胞因子，其在免疫应答和炎性疾病中起到重要作用。其被描述为炎性反应、免疫反应和病理生理学反应的关键介导物。TNFα主要通过单核细胞和活化巨噬细胞分泌，其还通过众多其它细胞类型，包括成纤维细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和上皮细胞来产生。TNFα还被称为恶液质素，其以两种生物活性形式存在：跨膜形式和可溶性形式。TNFα的可溶性形式通过蛋白酶剪切从跨膜TNFα(tmTNFα)释放。两种TNFα形式都是生物活性三聚体，结合TNF受体和发挥各种生物功能以帮助宿主防御。另外，跨膜和可溶性TNFα两者都在炎性和自身免疫疾病的发病机理中起作用。鉴定出TNFα的两种受体(TNF-R1和-R2)介导多效TNFα效应。这些受体在各种细胞上表达，主要在单核细胞和巨噬细胞上表达。受体活化引发各种生物效应，包括促炎细胞因子产生例如IL-1、TNFα、IL-6、IL-8；趋化因子产生；嗜中性粒细胞活化；增加内皮层的渗透性；和粘着分子的表达。因此，大量疾病与上调的TNFα水平相关，并因此TNFα抑制剂在医学治疗方面发现大量用途。数量日益增长的TNFα抑制剂的一个重要的子类是生物药物。一些TNFα的生物抑制剂受到监管批准并且可市售。一组此类生物抑制剂是全长免疫球蛋白。例如，英夫利昔单抗一种约150kDa的嵌合IgG，已被批准用于治疗克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病和贝赛特氏症(disease)。阿达木单抗一种约150kDa的IgG1，被批准用于类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎和贝赛特氏症。最后，戈利木单抗一种约150kDa分子量的人IgG1，被批准用于类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎。还有，一些经批准的生物TNFα抑制剂偏离全长免疫球蛋白结构。例如，依那西普是一种具有150kDa的分子量的TNF-受体2胞外结构域Fc融合蛋白，其已被批准用于治疗类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、银屑病和强直性脊柱炎。另外，赛妥珠单抗一种约90kDa的人源化Fab-PEG缀合物，被批准并广泛用于治疗克罗恩病和类风湿性关节炎。尽管本领域中有进展，但是仍存在对于具有优化的生物物理学特征的组合的生物制剂的需要。例如，皮肤病的局部治疗，即将TNFα抑制剂局部应用至皮肤，将是非常优选的应用途径，因为可避免全身治疗的副作用。但是，迄今为止，此类治疗是不可行的，尤其是，因为目前批准的免疫治疗剂太大而因此不能跨越皮肤角质层和/或归因于药物生产成本。TNFα在银屑病和银屑病性关节炎中的关键作用是确立的(参见，例如CORDORO、KM和FLEDMANSR.TNF-alphainhibitorsindermatology.SkinTherapyLetter2007,第12卷,第4-6页)。银屑病是患病率为2-3％的常见疾病。虽然较轻度的形式可采用糖皮质激素和/或维生素D3-类似物进行局部治疗，但是更严重的形式需要全身治疗，包括环孢霉素、甲氨蝶呤或最终生物制剂(Prieto-PérezR.等人,Pharmacogenomics.2013年10月；14(13):1623-1634)。涉及使用单克隆抗体靶向例如TNFα(阿达木单抗、依那西普和英夫利昔单抗)的用于严重银屑病的全身治疗的生物疗法的引入已基本上解决了罹患严重形式银屑病的患者的医疗需求。虽然是高度有效的，但是这些药物与一些潜在严重和重大的不良事件相关。因此，这些药物的收益风险比状况排除了大多数呈现轻度至中度形式银屑病的银屑病患者。可能例如通过局部应用生物药物(即局部施用)来减少副作用。但是，归因于它们的大尺寸，全长抗体不适于此类施用途径。化脓性汗腺炎，也称作反常性痤疮(acneinversa)，是另一种TNFα相关病症。所述炎性慢性疾病通过带有顶泌腺的皮肤(例如腋窝、大腿内侧、腹股沟和臀部)中的脓肿簇来表征(SCHEINFELD,N.Hidradenitissuppurativa:Apracticalreviewofpossiblemedicaltreatmentsbasedonover350hidradenitispatients.DermatolOnlineJournal2013,第19卷,第1页)。TNFα抑制剂已成功用于治疗所述罕见疾病(orphandisease)(BrunassoAM,MassoneC.Treatmentofhidradenitissuppurativawithtumournecrosisfactor-alphainhibitors:Anupdateoninfliximab.ActaDermVenereol.2011,第91(1)卷,第70页；SotiriouE.等人,Etanerceptforthetreatmentofhidradenitissuppurativa,ActaDermVenereol.2009,第89(1)卷,第82-3页)。针对TNFα的抗体也已有效用于治疗另一种罕见皮肤病坏疽性脓皮病(ReddickCL等人.Successfultreatmentofsuperficialpyodermagangrenosumassociatedwithhidradenitissuppurativawithadalimumab.DermatolOnlineJ.2010,第16(8)卷,第15页)。迄今为止，还未批准用于治疗此类罕见疾病的生物药物，然而，市售生物制剂为标签外使用。概述在第一方面，提供TNFα的结合成员。在一些实施方式中，所述结合成员是人源化的，并中和可溶性TNFα的活性。在一些实施方式中，所述结合成员是具有对TNFα有特异性的免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。在一些实施方式中，所述结合成员是对TNFα有特异性的免疫球蛋白。在一些实施方式中，所述结合成员是对TNFα有特异性的抗体片段。在一些实施方式中，所述结合成员是哺乳动物免疫球蛋白或其片段。在一些实施方式中，所述结合成员是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合成员，其具有对TNFα的结合特异性，所述结合成员包含(i)如SEQ ID No:6、7和8中所示的可变重链CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3序列中的至少一种；和/或(ii)如SEQ ID No:3、4和5中所示的可变轻链CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3序列中的至少一种；或其变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.26 EP 14001123.01.一种结合成员，其具有对TNFα的结合特异性，所述结合成员包含(i)如SEQIDNo:6、7和8中所示的可变重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列中的至少一种；和/或(ii)如SEQIDNo:3、4和5中所示的可变轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的至少一种；或其变体。2.权利要求1所述的结合成员，其中所述结合成员具有关于人TNFα的低于50pM的IC50，其中所述结合成员任选为单价结合成员，例如scFv。3.权利要求1或2所述的结合成员，其为人源化的。4.权利要求1至3中任一项所述的结合成员，其包含(i)与SEQIDNo.1具有至少90％序列同一性的可变轻链；和/或(ii)与SEQIDNo.2具有至少90％序列同一性的可变轻链。5.权利要求1至4中任一项所述的结合成员，其进一步包含接头序列，其中所述接头序列是SEQIDNo:10中所示的序列，或其变体。6.权利要求5所述的结合成员，其包含SEQIDNo.9。7.权利要求1至6中任一项所述的结合成员，其中所述可变重链进一步包含以下残基中的至少一种：(i)在重链氨基酸12位上的丝氨酸(S)(根据AHo编号)；(ii)在重链氨基酸103位上的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)(根据AHo编号)；和/或(iii)在重链氨基酸144位上的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)(根据AHo编号)。8.权利要求1至7中任一项所述的结合成员，其为或包含(i)抗体片段例如Fab、Fab’、F(ab)’2、scFv、Fv片段、纳米抗体、VHH或最小识别单元；(ii)全长免疫球蛋白分子；和/或(iii)非免疫球蛋白支架例如亲和体、affilin分子、AdNectin、脂质运载蛋白突变蛋白、DARPin、Knottin、Kunitz类型结构域、Avimer、四连接素或反式体。9.权利要求1至8中任一项所述的结合成员，其为单价或多价的，其中所述结合成员任选为双特异性的，优选是双抗体、单链双抗体或串联scFv。10.权利要求1至9中任一项所述的结合成员，其以10mg/mlPBSpH7.2的浓度在37℃下培育1周以后保持至少93％为单体的。11.权利要求1至10中任一项所述的结合成员，其为化学或生物修饰的。12.权利要求11所述的结合成员，其为糖基化、PEG化或HES化的。13.一种结合成员，其特异性结合TNFα，其中所述结合成员具有如通过抑制PK-15细胞中的TNFα诱导的细胞毒性所测量的关于人TNFα的低于100pM的效力IC50，其中所述结合成员交叉阻断权利要求1至12中任一项所述结合成员与TNFα的特异性结合。14.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1至13中任一项所述的结合成员的序列。15.一种载体，其包含根据权利要求14所述的核酸分子的序列。16.一种宿主细胞，其包含权利要求14所述的核酸分子或权利要求15所述的载体。17.一种组合物，其包含权利要求1至13中任一项所述的结合成员、权利要求14所述的核酸分子、权利要求15所述的载体或权利要求16所述的宿主细胞；和另外合适的载体、稀释剂或赋形剂。18.权利要求17所述的组合物，其为化妆品组合物、诊断组合物或药物组合物。19.权利要求18所述的组合物，其为药物组合物并且所述载体为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。20.权利要求19所述的组合物，其为适用于肠胃外、经口、直肠、全身、经泌尿生殖器、局部、玻璃体内、眼内、经耳、鼻内、经皮、舌下或口腔施用的形式。21.一种治疗TNFα介导的疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用权利要求18至20中任一项所述的药物组合物。22.权利要求21所述的方法，其中所述TNFα介导的疾病为以下疾病中的至少一种：增殖型糖尿病性视网膜病变、痛风性关节炎...

【专利技术属性】
技术研发人员：A尚希夫，T克雷茨施马，
申请(专利权)人：细胞药物瑞士股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH