重组肉毒梭菌神经毒素的制造制造技术

本发明专利技术提供用于产生可溶性双链BoNT/A蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及用于产生重组血清型A肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神经毒素(BoNT/A)的方法。专利技术背景肉毒神经毒素(BoNT)由肉毒梭菌以巨大蛋白质复合物的形式产生，由本身复合于众多辅助蛋白的BoNT组成。目前存在至少7个不同类别的肉毒神经毒素，即：肉毒神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，它们均共有相似的结构和作用模式。最近报告了一种可能的第八血清型，H，但是序列尚未公开。不同的BoNT血清型可以基于被特异性中和性抗血清失活而区分开，而借助血清型的这种分类与氨基酸水平的序列同一性百分数相关。基于氨基酸序列同一性百分数，将给定血清型的BoNT蛋白进一步划分成不同亚型。BoNT是已知最强效的毒素，取决于血清型，小鼠的中位数致死剂量(LD50)值范围从0.5ng/kg至5ng/kg。BoNT在胃肠道中吸收，并且在进入体循环后，与胆碱能神经末梢的突触前膜结合并阻止神经递质乙酰胆碱释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G切割小突触泡蛋白/囊泡相关膜蛋白(VAMP)；BoNT/C、BoNT/A和BoNT/E切割25kDa突触小体相关蛋白(SNAP-25)；并且BoNT/C切割突触融合蛋白。在自然界中，梭菌神经毒素作为单链多肽合成，所述单链多肽通过蛋白酶剪切事件受到翻译后修饰，以形成由二硫键连接在一起的两条多肽链。切割过程在位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的特异性切割位点(经常称作活化位点)发生。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链称作重链(H-链)，其具有大约100kDa分子质量，和轻链(L-链或LC)，其具有大约50kDa分子质量。H-链包含C末端靶向组分(HC结构域)和N末端易位组分(HN结构域)。切割位点位于暴露的环区域内的L-链和易位组分之间(参见表1)。在HC结构域与其靶神经元结合并且结合的毒素借助内体内化入细胞后，HN结构域使L-链跨过内体膜易位并进入细胞溶胶，并且L-链提供蛋白酶功能(也称作非细胞毒蛋白酶)。非细胞毒蛋白酶通过蛋白水解切割称作SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)的胞内转运蛋白发挥作用–参见GeraldK(2002)\CellandMolecularBiology”(第4版)JohnWiley&Sons,Inc。首字母缩略词SNARE衍生自术语可溶性NSF接合受体，其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺敏感因子。SNARE蛋白对胞内小泡融合不可或缺，并且因此对分子借助小泡运输从细胞分泌不可或缺。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且对SNARE蛋白显示出高度的底物特异性。因此，一旦输送至所需的靶细胞，非细胞毒蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L-链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒蛋白酶。肉毒神经毒素因其引起肌肉松弛麻痹的能力著称。所述肌肉松弛特性已经导致肉毒神经毒素(如BoNT/A)用于多种医学手术和美容手术，包括治疗眉间纹或运动过多面纹、头痛、半侧面肌痉挛，膀胱过兴奋、多汗症、鼻唇沟线、颈肌张力障碍、睑痉挛和强直。传统上，通过培养肉毒梭菌细菌，随后分离和纯化肉毒神经毒素复合物，实施BoNT的生产。然而，以这种方式生产BoNT低效并且提供低的蛋白质产率。此外，肉毒梭菌是形成孢子的细菌并且因此需要专用培养设备和设施，培养诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)之类的细菌不需要所述设备和设施。BoNT的使用增加导致用于产生和纯化BoNT的替代性方法开发。特别地，已经开发了使用大肠杆菌产生BoNT的方法。从发酵液(无论是否使用肉毒梭菌或大肠杆菌)纯化CNT是一项特殊挑战，因为其中含有多种神经毒素作为未加工、部分加工和完全加工的多肽的混合物，其均具有非常相似的生物化学特性和物理特性。如果内切蛋白水解活性已经水解轻链和环之间的肽键，而环和重链N末端之间的肽键仍然完整，则一般生成部分加工的神经毒素。另外，如果内切蛋白水解活性已经从重链释放环肽，而环肽和轻链C末端具之间的肽键尚未水解，则也可以产生部分加工的神经毒素。取决于发酵条件和神经毒素的类型，缺少环肽的完全加工的多肽能遭受5％至90％之间部分加工的多肽或未加工的多肽显著污染。在一些情况下，神经毒素主要地是未加工的并且在治疗性使用之前，需要用内肽酶处理以变得有生物活性。现有技术描述了用异源蛋白酶处理梭菌神经毒素以减少未加工的或部分加工的前体蛋白数量的多种尝试。尽管可用于活化血清型B(BoNT/B)和E(BoNT/E)梭菌神经毒素，最广泛用于活化梭菌神经毒素的蛋白酶，胰蛋白酶，似乎推定地在BoNT/A的重链亚基的C末端通过蛋白水解作用产生产生次级产物，并且因此似乎摧毁毒素与其细胞受体的结合作用。理论上从分离自天然宿主(如产生BoNT/A的肉毒梭菌)的内源蛋白酶预期了更多的特异性切割产物。专利技术人先前已经鉴定各种蛋白酶，如来自肉毒梭菌的内源蛋白酶和包括内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)(其为市售并可以从产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)分离)的外源蛋白酶。但是，虽然由这种内切蛋白酶切割重组BoNT/A更精确地反映天然切割过程，但是Lys-C的使用提出了新的实践考虑问题。特别地，在切割重组BoNT/A后，Lys-C能够在反应混合物中数天仍有活性。因此，用于减少终产物中Lys-C的量并因而改善神经毒素制备物品质的手段和方法是迫切需要但是尚未可得的。因此，作为本专利技术基础的技术问题可以视为通过满足前述需要提供用于改善神经毒素多肽制造的工具和方法。具体而言，本领域需要用于产生重组BoNT、尤其活化的双链重组BoNT/A的改进方法。这个技术问题通过权利要求中及下文表征的实施方案来解决。专利技术简述可以通过大肠杆菌中作为单一多肽(本文中称作单链BoNT/A蛋白)表达，实现重组BoNT/A亚血清型的产生。一旦通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)分离这种单链蛋白，则必须切割单链蛋白以形成活性毒素，所述活性毒素是由单个二硫键连接在一起的双链蛋白质。专利技术人先前已经发现，可以使用蛋白酶内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)切割重组单链BoNT/A亚血清型以产生活性双链BoNT/A蛋白神经毒素，即BoNT/A轻链和重链的异二聚体。通过N端测序和质谱法确定Lys-C切割位点与内源蛋白相同。因此，使用Lys-C产生活性双链BoNT/A蛋白是有利的，因为它导致产生有真实活性的双链BoNT/A，即基本上与天然活性双链BoNT/A相同的双链BoNT/A。相反，胰蛋白酶，另一种用来产生活性双链BoNT蛋白的常见蛋白酶，切割BoNT/A单链序列内部的至少一个额外位点。这种额外切割降低所产生的活性双链BoNT/A蛋白的效力。一旦单链BoNT/A蛋白已经由Lys-C切割，则活性双链BoNT/A蛋白需要纯化以移除任何剩余的宿主细胞蛋白和Lys-C蛋白酶以产生最终的纯产物。特别地，从内切蛋白酶Lys-C切割试验中，专利技术人已经发现，Lys-C在很低的浓度切割重组BoNT/A1(rBoNT/A1)并且在数天时间内仍保持活性。因此，重要的是开发可以从活化的毒素纯化除去这种蛋白酶的方法。专利技术人已经开本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于产生可溶性双链BoNT/A蛋白的方法，所述方法包括：a)提供可溶性单链BoNT/A蛋白；b)在溶液中使所述BoNT/A蛋白与内切蛋白酶Lys‑C(Lys‑C)接触；并且c)通过使含有可溶性BoNT/A蛋白和Lys‑C的溶液与疏水表面接触，从Lys‑C分离可溶性BoNT/A蛋白，其中可溶性BoNT/A蛋白偏好地与疏水表面结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.29 GB 1407525.31.用于产生可溶性双链BoNT/A蛋白的方法，所述方法包括：a)提供可溶性单链BoNT/A蛋白；b)在溶液中使所述BoNT/A蛋白与内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)接触；并且c)通过使含有可溶性BoNT/A蛋白和Lys-C的溶液与疏水表面接触，从Lys-C分离可溶性BoNT/A蛋白，其中可溶性BoNT/A蛋白偏好地与疏水表面结合。2.根据权利要求1所述的方法，其中(i)通过在表达系统中表达编码所述单链BoNT/A蛋白的核酸在宿主细胞中；或(ii)在体外表达系统中产生可溶性单链BoNT/A蛋白。3.根据权利要求2所述的方法，其中宿主细胞是细菌宿主细胞并且表达系统是细菌表达系统。4.根据权利要求3所述的方法，其中细菌表达系统是大肠杆菌表达系统并且宿主细胞是大肠杆菌细胞。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述可溶性单链BoNT/A蛋白在所述宿主细胞的细胞质中表达。6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述可溶性单链BoNT/A蛋白以至少5mg/L的水平表达。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，包括溶解细菌或大肠杆菌宿主细胞以提供含有所述可溶性单链BoNT/A蛋白的细菌或大肠杆菌宿主细胞匀浆。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中疏水表面是附着有由芳基或烷基组成的配体的惰性基质。9.根据权利要求8所述的方法，其中配体选自丁基、苯基或辛基配体。10.根据权利要求9所述的方法，其中使用高性能疏水表面。11.通过根据权利要求1至10中任一项所述的方法可获得的活性双链BoNT/A蛋白。12.组合物，包含根据权利要求11所述的活性双链BoNT/A蛋白；其中所述组合物基本上不含内切蛋白酶Lys-C。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物包含少于5％的单链BoNT/A或少于2％的单链BoNT/A。14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中所述组合物含有少于400pg内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)每100ngBoNT/A蛋白、或少于3...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·帕兰，S·M·刘，G·S·哈克特，
申请(专利权)人：益普生生物创新有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB