用于视锥细胞中增强的基因表达的组合物和方法技术

本公开提供用于在视锥细胞中表达基因的多核苷酸盒，表达载体和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2014年3月17日提交美国临时专利申请序列号61/954,330和在2015年3月2日提交的美国临时专利申请序列号62/127,185的申请日的优先权，将其完整公开内容通过引用并入本文。关于序列表的陈述以文本格式提供与本申请相关的序列表以代替纸件，并且在此通过引用并入本说明书。含序列表的文本文件的名称是AVBI_005_02WO_ST25.txt。该文本文件为308KB，于2015年3月17日创建，并通过EFS-Web电子提交。专利
本专利技术涉及视网膜疾病的基因疗法。专利技术背景眼睛的视觉病症常常涉及到视锥细胞中已知的主要缺陷。这些包括黄斑营养不良如斯塔加特黄斑营养不良，锥体营养不良，锥体-视杆营养不良，脊髓小脑性共济失调7型和巴尔得-别德尔综合征-1，以及色觉病症，包括全色盲，蓝色锥体单色视觉，和红色觉异常，绿色觉异常，和蓝色色觉缺陷。除了其中已知的原因是锥体光感受器固有的那些病症外，存在可以通过靶向锥细胞被治疗的中心黄斑视觉病症(灵长类内)。这些病症包括年龄相关性黄斑退化症，黄斑毛细血管扩张，色素性视网膜炎，糖尿病性视网膜病，视网膜静脉闭塞，青光眼，索斯比眼底营养不良，成人卵黄状黄斑营养不良，贝斯特病，和X连锁视网膜劈裂症。治疗和预防眼科疾病以解决现有的治疗的限制的有希望的方法是用基因治疗载体如腺伴随病毒(AAV)将治疗剂递送至眼。AAV是一个4.7kb的单链DNA病毒。基于AAV的重组载体与优异的临床安全性有关，因为野生型AAV是非致病性，并且与任何已知的疾病无病因学关联。此外，AAV提供了在许多组织，包括眼，肌肉，肺，脑中高效的基因递送和持续的转基因表达的能力。此外，AAV已经显示出在人类临床试验的希望。一个实例是利伯先天性黑蒙，其中用通过rAAV载体的单个视网膜下施用递送治疗剂治疗的患者经历了来自治疗剂的表达的持续临床益处，从治疗的起始日期起超过四年。在设计用于基因疗法以一般性地治疗眼病且特别治疗视锥细胞的核苷酸盒和表达载体中仍然存在许多挑战。一个显著挑战是获得在靶细胞中，尤其是在视网膜的视锥细胞中转基因的足够表达。在本领域中一个长期未能满足的需要是基因转移后转基因的充分有力的表达。在某些情况下，对于某些载体，例如质粒DNA载体的功效需要更有效的表达。在其它情况下，更有效的基因表达盒是期望的，以允许具有更有利的安全性或的更少侵入的施用途径(例如，玻璃体内对视网膜下)的较低治疗剂量。在一些设置中，已使用强的，遍在的启动子实现有效表达，但通常希望使用仅在靶细胞类型中表达的核酸表达盒而具有高的转基因表达。以前在视锥细胞中表达转基因所作的努力(例如如美国专利申请US2012/0172419所公开的)显示出一些希望，但经常表达水平低于最佳或不是细胞特异性的。鉴于多种视觉病症由视锥细胞中的主要缺陷引起，转基因在视锥细胞中以高表达水平特异性表达将代表在本领域中一个有意义的进步。因此，仍然需要用于在视锥细胞中表达基因的改进的方法和优化的核酸盒和载体。专利技术概述本公开提供用于在视锥细胞中表达基因的多核苷酸盒，表达载体和方法。在本专利技术的一些方面，提供了用于在哺乳动物视网膜视锥细胞中表达转基因的多核苷酸盒。在一些实施方案中，转基因的表达是被增强的表达。在某些实施方案中，编码序列的表达大于可操作地连接到SEQIDNO:1的转基因的表达。在一些实施方案中，转基因的表达是视锥特异性的(cone-specific)。在一些实施方案中，多核苷酸盒包含启动子区和多聚腺苷酸化位点，其中所述启动子区促进基因在视网膜视锥细胞中的表达。在一些实施方案中，表达特异性在视锥细胞中。在一些这样的实施方案中，启动子区包括多核苷酸序列，其与选自SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:53，SEQIDNO:54，SEQIDNO:55，SEQIDNO:79，SEQIDNO:80，SEQIDNO:81，SEQIDNO:82，SEQIDNO:83的序列或其功能性片段具有85％或更多的序列同一性。在一些实施方案中，启动子区的长度小于492个核苷酸。在一些实施方案中，启动子区基本上由与SEQIDNO:55的全长或其功能性片段具有85％或更多的序列同一性的多核苷酸组成。在一些实施方案中，多核苷酸盒包含编码用于编码序列的5’非翻译区的多核苷酸序列，在本文中称为5’UTR。在一些这样的实施方案中，5’UTR包括与选自SEQIDNO:56，SEQIDNO:57，SEQIDNO:58，SEQIDNO:84，SEQIDNO:85，SEQIDNO:86，SEQIDNO:87，SEQIDNO:88，和SEQIDNO:89的序列或其片段具有85％或更多的序列同一性的序列。在一些实施方案中，一些或所有的5’UTR序列包含在如例如SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:53，SEQIDNO:54，SEQIDNO:55,或SEQIDNO:79所公开的启动子区中。在一些实施方案中，5’UTR序列是与启动子序列异源的。在一些实施方案中，5’UTR基本上由与SEQIDNO:85或SEQIDNO:86的全长或其片段具有85％或更多的序列同一性的序列组成。在一些实施方案中，5’UTR不包含多核苷酸ATG。在一些实施方案中，多核苷酸盒包含内含子。在一些这样的实施方案中，内含子包括与选自SEQIDNO:5，SEQIDNO:59，和SEQIDNO:60的序列或具有85％或更多的序列同一性的序列。在某些实施方案中，内含子位于编码5’UTR的多核苷酸序列内。在一些实施方案中，多核苷酸盒包含翻译起始序列。在一些这样的实施方案中，翻译起始序列包含基本上由SEQIDNO:72或SEQIDNO:73组成的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸盒包括增强子序列。在一些这样的实施方案中，增强子序列包括与SEQIDNO:52或其功能性片段具有85％或更多的序列同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，增强子序列基本上由与SEQIDNO:51的全长具有85％或更多的序列同一性的序列组成。在一些实施方案中，多核苷酸盒包含可操作地连接于启动子的编码序列。在一些实施方案中，编码序列是与启动子区和/或5’UTR序列异源的。在一些实施方案中，编码序列编码多肽，其与SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，SEQIDNO:21，SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQIDNO:25，SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，SEQIDNO:29，SEQIDNO:30，SEQIDNO:31，SEQIDNO:32，SEQIDNO:33，SEQIDNO:35，SEQIDNO:37，SEQIDNO:39，SEQIDNO:41，SEQIDNO:43，SEQIDNO:45，SEQIDNO:47，SEQIDNO:49和SEQIDNO:11的同质多象变体具有至少85％，90％，或95％的序列同一性，所述SEQIDNO:11的同质多象变体选自(i)T本文档来自技高网...

【技术保护点】
多核苷酸盒，其用于哺乳动物视网膜的视锥细胞中的转基因的增强的表达，所述多核苷酸盒包括：(a)启动子区，其中所述启动子区对于视网膜视锥细胞是特异性的；(b)编码序列，其可操作地连接于启动子区；和(c)多聚腺苷酸化位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.17 US 61/954,330;2015.03.02 US 62/127,1851.多核苷酸盒，其用于哺乳动物视网膜的视锥细胞中的转基因的增强的表达，所述多核苷酸盒包括：(a)启动子区，其中所述启动子区对于视网膜视锥细胞是特异性的；(b)编码序列，其可操作地连接于启动子区；和(c)多聚腺苷酸化位点。2.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述启动子区包含与选自SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:53，SEQIDNO:54，SEQIDNO:55，SEQIDNO:79，SEQIDNO:80，SEQIDNO:81.SEQIDNO:82，和SEQIDNO:83的序列或其功能性片段具有85％或更多的序列同一性的多核苷酸序列。3.权利要求2的多核苷酸盒，其中所述启动子区基本上由与SEQIDNO:55的全长或其功能性片段具有85％或更多的序列同一性的多核苷酸序列组成。4.权利要求1-3中任一项的多核苷酸盒，其包含编码所述编码序列5’的非翻译区的多核苷酸序列。5.权利要求4的多核苷酸盒，其中编码所述编码序列5’的非翻译区的所述多核苷酸序列包含与选自SEQIDNO:56，SEQIDNO:57，SEQIDNO:58，SEQIDNO:84，SEQIDNO:85，SEQIDNO:86，SEQIDNO:87，SEQIDNO:88，和SEQIDNO:89的序列或其功能性片段具有85％或更多的序列同一性的序列。6.权利要求4或5的多核苷酸盒，其中所述编码序列5’的非翻译区不包含多核苷酸ATG。7.权利要求4的多核苷酸盒，其中编码所述编码序列5’的非翻译区的所述多核苷酸序列基本上由与SEQIDNO:85或SEQIDNO:86的全长或其片段具有85％或更多的序列同一性的序列组成。8.权利要求1-7中任一项的多核苷酸盒，其进一步包含内含子。9.权利要求8的多核苷酸盒，其中所述内含子包含与选自SEQIDNO:5，SEQIDNO:59，和SEQIDNO:60的序列具有85％或更多的序列同一性的序列。10.权利要求9的多核苷酸盒，其中所述内含子位于编码所述编码序列5’的非翻译区的多核苷酸序列内。11.权利要求1-10中任一项的多核苷酸盒，其进一步包含翻译起始序列。12.权利要求11的多核苷酸盒，其中所述翻译起始序列包含基本上由SEQIDNO:72或SEQIDNO:73组成的多核苷酸序列。13.权利要求1-12中任一项的多核苷酸盒，其进一步包含与SEQIDNO:52或其功能性片段具有85％或更多的序列同一性的增强子序列。14.权利要求13的多核苷酸盒，其中所述增强子序列基本上由与SEQIDNO:51的全长具有85％或更多的序列同一性的序列组成。15.权利要求1-14中任一项的多核苷酸盒，其中当导入哺乳动物视锥细胞中时，所述编码序列的表达大于在所述启动子区被替换为SEQIDNO:1的启动子区时的所述编码序列的表达。16.重组腺伴随病毒(rAAV)，其包含：a)AAV壳体蛋白，和b)侧翼有AAVITR的权利要求1-15中任一项的多核苷酸盒。17.药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项的多核苷酸盒或权利要求16的rAAV和药用赋形剂。18.用于在视锥细胞中表达转基因的方法，其包括使一个或多个视锥细胞与有效量的权利要求1-15中任一项的多核苷酸盒或权利要求16的重组腺伴随病毒接触，其中在所述一个或多个视锥细胞中以可检测的水平表达所述转基因。19.根据权利要求18的方法，其包括检测在所述视锥细胞中的所述表达，其中在60％或更多的所述视锥细胞中检测到表达。20.根据权利要求19的方法，其中在视锥细胞中以可检测的水平特异性表达所述转基因。21.用于在需要治疗或预防视锥细胞病症的哺乳动物中治疗或预防视锥细胞病症的方法，该方法包括将有效量的权利要求17的药物组合物施用于所述哺乳动物的眼，其中所述编码序列编码治疗性基因产物。22.权利要求21的方法，其中所述视锥细胞病症是黄斑营养不良(maculardystrophy)，色觉病症(colorvisiondisorder)，或中央黄斑视觉病症(visiondisorderofthecentralmacula)。23.权利要求22的方法，其中所述色觉病症选自全色盲(achromotopsia)，蓝锥单色视(blueconemonochromacy)，红色觉异常缺陷(protandefect)，绿色觉异常缺陷(deutandefect)和蓝色色觉缺陷(tritandefect)。24.权利要求22或23的方法，其中所述方法还包括检测所述疾病症状的变化，其中所述变化包括所述哺乳动物感知颜色的能力的增加。25.权利要求21的方法，其中所述黄斑营养不良选自下组：斯塔加特(Stargardt)氏黄斑营养不良，锥体营养不良(conedystrophy)，锥体-视杆营养不良(cone-roddystrophy)，脊髓小脑性共济失调7型(Spinocerebellarataxiatype7)和巴尔得-别德尔(Bardet-Biedl)综合征-1。26.权利要求21的方法，其中所述中央黄斑视觉病症选自：年龄相关性黄斑退化症(age-relatedmaculardegeneration)，黄斑毛细血管扩张(maculartelangiectasia)，色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)，糖尿病性视网膜病(diabeticretinopathy)，视网膜静脉闭塞(retinalveinocclusions)，青光眼，索斯比(Sorsby)氏眼底营养不良，成人卵黄状黄斑营养不良(adultvitelliformmaculardystrophy)，贝斯特(Best)氏病，视杆-视锥营养不良(rod-conedystrophy)，利伯(Leber)氏先天性黑蒙，和X连锁视网膜劈裂症(X-linkedretinoschisis)。27.权利要求25或26的方法，其中所述方法还包括检测所述疾病症状的变化，其中所述变化包括降低所述哺乳动物的视敏度丧失的速率。28.多核苷酸盒，其用于哺乳动物视网膜的视锥细胞中的转基因的增强的表达，所述多核苷酸盒包含：(a)启动子区，其中所述启动子区对于视网膜视锥细胞是特异性的；(b)编码序列，其可操作地连接于所述启动子区；和(c)多聚腺苷酸化位点。29.多核苷酸盒，其用于哺乳动物视网膜的视锥细胞中的转基因的增强的表达，所述多核苷酸盒包括：(a)启动子区，其中所述启动子区对于视网膜视锥细胞是特异性的；(b)5’非翻译区；(c)内含子；(d)翻译起始序列；(e)编码序列，其可操作地连接于所述启动子区；和(f)多聚腺苷酸化位点。30.权利要求28或29的多核苷酸盒，其中所述转录起始位点和所述翻译起始位点之间的序列不含多核苷酸ATG。31.权利要求28或29的多核苷酸盒，其中所述启动子区的长度小于492个碱基对。32.权利要求28或29的多核苷酸盒，其中具有所述启动子区的所述编码序列的表达大于用以SEQIDNO:1所列出的启动子区的表达。33.权利要求28或29的多核苷酸盒，其中所述转录起始位点和编码序列的末端之间的序列不含除所述转基因可读框之外的长度超过500个核苷酸的可读框。34.权利要求28或29的多核苷酸盒，其中所述转录起始位点和编码序列的末端之间的序列不含除所述转基因可读框之外的长度超过250个核苷酸的可读框。35.权利要求28或29的多核苷酸盒，其中所述转录起始位点和编码序列的末端之间的序列不含除所述转基因可读框之外的长度超过100个核苷酸的可读框。36.权利要求28或29的多核苷酸盒，其中所述盒不含除所述编码序列的可读框之外的大于273bp的可读框。37.权利要求28或29的多核苷酸盒，其中所述编码序列编码治疗性蛋白质，其包含选自下组的多肽：SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，SEQIDNO:21，SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQIDNO:25，SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：J奈茨，M奈茨，TW卡尔伯格，
申请(专利权)人：阿德夫拉姆生物技术股份有限公司，华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：美国;US