本发明专利技术公开了一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法与应用；本发明专利技术公开的染料检测蛋白浓度范围为0.1‑25 ug/mL，灵敏度高；受测样本不论为纯化蛋白或抗体皆适用，还可应用于含有还原剂、核酸、氨基酸与咪唑的蛋白样品；对盐类、缓冲液、去垢剂或其他化学物质都有良好的耐受性；高度均一性好；灵敏度高；还具有线性关系好、可重复性强、稳定性好、操作简单等优点，解决了现有蛋白定量分析方法中常见的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法与应用。
技术介绍
在生物学研究中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是经常进行的一项非常重要而且不可缺少的工作。在日常科研中，由于蛋白样品的微量性，蛋白定量的结果不仅需要非常精确，而且要求进行蛋白定量的方法具备非常高的灵敏度；除此之外，抗干扰能力、检测试剂稳定、操作简单也是进行蛋白定量分析方法所必须考虑的因素。蛋白质定量分析的方法有许多种。从技术原理上分，可以分为两大类。科研上常以光度测定（photometric）进行蛋白质定量，通过染料与蛋白相互作用，由已知浓度的蛋白质标准品的吸光值或荧光强度，来测定未知浓度的蛋白质样本。基于吸光值的蛋白定量方法被称之为第一类蛋白定量方法，如BCA法、Bradford法、Lowry法，这类试剂的检测结果存在线性度不佳、灵敏度差、检测时间较长、样品需求量大、抗干扰能力差且测量范围窄等缺点，因此在科研上的应用备受限制；第二类是以荧光染料为核心开发的蛋白定量方法，如Thermo公司旗下MolecularProbes的NanoOrange以及CBQCA，与第一类试剂相比，这类试剂在灵敏度方面得到较大提高。其中，CBQCA试剂本身几乎是无荧光的，但当在氰化物的存在情况下，它与蛋白质的伯胺相互作用形成高荧光性的物质，通过Ex/Em=450/550nm对其荧光进行检测来计算蛋白质浓度。另外一种NanoOrange试剂在水溶液中也是不会发荧光的，只有与蛋白相互作用后，在Ex/Em=470/570nm处检测到最强荧光，通过荧光计、荧光酶标仪等检测荧光，从而定量蛋白质含量。CBQCA试剂存在明显弊端，在其与蛋白质反应过程中需要氰化物的帮助，才能形成可检测的荧光物质，并且这种试剂的操作繁琐，仅孵育步骤就需要至少1小时以上。NanoOrange试剂虽然克服了CBQCA的缺点，但是依然存在很多问题，如NanoOrange检测范围狭窄，仅为0.1-10ug/mL，线性度不佳，整个测量范围内，线性相关系数R2达不到0.99以上（R2越接近1表示线性度越好，只有在小数点之后有两个9以上才被认为线性度好），尤其在指纹区（0-1.25ug/mL）范围更是达不到蛋白定量要求（在这个测量范围内，线性相关系数R2的值仅在0.92左右，远低于一般认可的0.95），重复性不好、信号稳定时间仅为6小时。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法；具备灵敏度高，线性关系好、抗干扰性强、稳定性好、操作简单等优点，解决了现有蛋白定量分析方法中常见的问题。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是：一种用于蛋白质定量的荧光染料，具有如下化学结构式：其中R1、R2独立的选自C1～C12的直链烷基；R3为-OH（羟基）、C1～C8的直链或者支链烷基、-OCH3（甲氧基）；n为3～12。本专利技术进一步公开了所述用于蛋白质定量的荧光染料的制备方法，包括以下步骤：（1）以取代苯胺化合物、溴化合物为原料，在碳酸盐存在下，制备得到中间体I；（2）以中间体I为原料，在三氯氧磷存在下，制备得到中间体II；（3）以4-甲基吡啶与环烷基磺酸为原料，制备得到中间体III；（4）以中间体II与中间体III为原料，在甲醇中反应制备得到用于蛋白质定量的荧光染料；所述取代苯胺化合物的化学结构式为：所述溴化合物的化学式为：R1R2Br；所述环烷基磺酸的化学结构式为：；n为3～12。具体的制备方法为：（1）反应瓶中加入取代苯胺化合物、溴化合物、碳酸盐以及溶剂，于80～100℃反应；反应结束后提纯得到中间体I；（2）反应瓶中加入溶剂，在氮气保护下，冰水浴条件下滴加三氯氧磷，滴加完成20～40分钟后滴加含有中间体I的1,2-二氯乙烷溶液，调节温度至80～100℃，反应；反应结束后提纯得到中间体II；（3）反应瓶中加入4-甲基吡啶、环烷基磺酸，于80～100℃搅拌反应；反应结束后提纯得到中间体III；（4）反应瓶中加入中间体II、中间体III、六氢哌啶、甲醇，于55～65℃；反应结束后提纯得到用于蛋白质定量的荧光染料。上述技术方案中，步骤（1）至（4）都采用TLC跟踪反应至完全结束；TLC跟踪时采用二氯甲烷/甲醇为展开剂，具体为体积比为90∶10的二氯甲烷/甲醇。取代苯胺化合物、溴化合物、碳酸盐的摩尔比为1∶2.5∶2.5；三氯氧磷、中间体I的摩尔比为4∶1；4-甲基吡啶、环烷基磺酸的摩尔比为1∶3.6；中间体II、中间体III、六氢哌啶的摩尔比为1.6∶1∶0.05。上述技术方案中，提纯具体为：（1）反应结束后，反应液冷却至室温后倒入清水中，然后用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，再用饱和食盐水洗涤；然后用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，收集旋干得到中间体I；过柱纯化时淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=95∶5；（2）反应结束后，反应液冷却至室温后倒入冰水中，然后用二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷层，再饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，收集旋干得到中间体II；过柱纯化时淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=95∶5；（3）反应结束后加入乙酸乙酯回流后降至常温，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，真空干燥后得到中间体III；（4）反应结束后，反应液旋干后硅胶过柱纯化，收集旋干得到用于蛋白质定量的荧光染料；过柱纯化时淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=95∶5。上述技术方案中，步骤（1）中，碳酸盐为碳酸钾，溶剂为二甲基甲酰胺。本专利技术用于蛋白质定量的荧光染料在蛋白质定量分析时，（1）灵敏度高，与现有BCA、Bradford或Lowry蛋白定量分析相比，本专利技术检测蛋白浓度范围为0.1-25ug/mL，灵敏度更佳；（2）应用广泛，本专利技术用于蛋白质定量的荧光染料受测样本不论为纯化蛋白或抗体皆适用，还可应用于含有还原剂、核酸、氨基酸与咪唑的蛋白样品；（3）耐受性好，本专利技术用于蛋白质定量的荧光染料对盐类、缓冲液、去垢剂或其他化学物质都有良好的耐受性；（4）高度均一性好，本专利技术用于蛋白质定量的荧光染料受蛋白组成差异的影响小，从而具有更出色的蛋白间均一性。因此本专利技术还公开了上述用于蛋白质定量的荧光染料在蛋白质定量分析中的应用以及上述用于蛋白质定量的荧光染料在制备蛋白质定量分析试剂中的应用。本专利技术还公开了一种蛋白质定量分析的方法，包括以下步骤：（1）将染料用缓冲液稀释得到染料工作液；所述染料为上述用于蛋白质定量的荧光染料；（2）将待检测蛋白质溶液与染料工作液混合后避光条件下加热处理；然后室温冷却；再经离心处理收集上清液为测试样本；（3）将测试样本加入酶标板；然后测试荧光强度；最后将荧光强度带入牛血清白蛋白溶液浓度与荧光强度关系曲线，得出待检测蛋白质浓度，完成蛋白质定量分析。牛血清白蛋白标准浓度与荧光强度关系曲线的制备为，配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液，然后避光条件下加热处理；然后室温冷却；再经离心处理收集上清液为测试样本；将不同浓度的待检测蛋白质溶液对应的样本分别加入酶标板中，分别测试荧光强度，从而得到荧光强度与牛血清白蛋白溶液浓度的关系曲线。可以将已知浓度的蛋白质溶液加入染料工作液中配制待检测蛋白质标准浓度溶液或者直接将待检测蛋白质本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于蛋白质定量的荧光染料，具有如下化学结构式：其中R1、R2独立的选自C1～C12的直链烷基；R3为‑OH、C1～C8的直链或者支链烷基、‑OCH3；n为3～12。
【技术特征摘要】
1.一种用于蛋白质定量的荧光染料，具有如下化学结构式：其中R1、R2独立的选自C1～C12的直链烷基；R3为-OH、C1～C8的直链或者支链烷基、-OCH3；n为3～12。2.权利要求1所述用于蛋白质定量的荧光染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以取代苯胺化合物、溴化合物为原料，在碳酸盐存在下，制备得到中间体I；（2）以中间体I为原料，在三氯氧磷存在下，制备得到中间体II；（3）以4-甲基吡啶与环烷基磺酸为原料，制备得到中间体III；（4）以中间体II与中间体III为原料，在甲醇中反应制备得到用于蛋白质定量的荧光染料；所述取代苯胺化合物的化学结构式为：所述溴化合物的化学式为：R1R2Br；所述环烷基磺酸的化学结构式为：；n为3～12。3.根据权利要求2所述用于蛋白质定量的荧光染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）反应瓶中加入取代苯胺化合物、溴化合物、碳酸盐以及溶剂，于80～100℃反应；反应结束后提纯得到中间体I；（2）反应瓶中加入溶剂，在氮气保护下，冰水浴条件下滴加三氯氧磷，滴加完成20～40分钟后滴加含有中间体I的1,2-二氯乙烷溶液，调节温度至80～100℃，反应；反应结束后提纯得到中间体II；（3）反应瓶中加入4-甲基吡啶、环烷基磺酸，于80～100℃搅拌反应；反应结束后提纯得到中间体III；（4）反应瓶中加入中间体II、中间体III、六氢哌啶、甲醇，于55～65℃反应；反应结束后提纯得到用于蛋白质定量的荧光染料。4.根据权利要求3所述用于蛋白质定量的荧光染料的制备方法，其特征在于：取代苯胺化合物、溴化合物、碳酸盐的摩尔比为1∶2.5∶2.5；三氯氧磷、中间体I的摩尔比为4∶1；4-甲基吡啶、环烷基磺酸的摩尔比为1∶3.6；中间体II、中间体III、六氢哌啶的摩尔比为1.6∶1∶0.05。5.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏继波，钱近春，谈雪良，赵文俊，
申请(专利权)人：苏州宇恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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