本发明专利技术公开一种牛支原体培养基及其制备方法。本发明专利技术的牛支原体培养基由基础培养基和辅助培养基混合构成，其中培养基的组成为：Friis media premix、丙酮酸钠、新鲜酵母浸出液、葡萄糖、酚红、去离子水、L‑谷氨酰胺、L‑半胱氨酸、水解乳蛋白、转铁蛋白、胰岛素、青霉素和少量马血清。本发明专利技术既能减少血清用量，还明显提高了牛支原体的活菌滴度，为牛支原体优质疫苗的研制奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种支原体培养基及其制备方法，确切讲是一种其组分中包括有：丙酮酸钠、新鲜酵母浸出液、葡萄糖、酚红、去离子水、青霉素和少量马血清的牛支原体培养基及其制备方法。
技术介绍
牛支原体（Mycoplasmabovis,M.bovis）能够引起牛肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病。该病原引起的疾病在全世界范围流行并造成严重经济损失。牛支原体是牛呼吸疾病综合征的主要病因。我国自2008年首次从湖北省爆发坏死性肺炎肉牛身上分离到牛支原体以来，随后在全国多个省市地区不断有牛支原体病例的报道，现今牛支原体在我国已成普遍感染状态，牛支原体也已经成为威胁我国养牛业的重要病原之一。牛支原体病的防控需要综合防控措施，疫苗免疫是预防控制牛支原体病发生的一个重要手段，而优质高效疫苗需要优质培养基作为支撑。目前牛支原体的培养基主要有牛心汤培养基、改良KM2培养基、改良Thiaucourt’s培养基等。现有技术培养基培养牛支原体存在培养时间较长、活菌滴度较低、繁殖能力较差等问题。此外，现有技术培养基中血清含量普遍在10%～20%之间，不仅增加了制苗成本，过量的血清制备的疫苗增加了异源体对牛体的过敏应激反应，最终影响疫苗的免疫效果。单纯降低现有技术培养基中血清含量会导致培养牛支原体抗原滴度低10～100倍左右，既达不到免疫所需抗原剂量，又需提高浓缩倍数，实际增加了生产成本。中国专利技术专利2011100012310公开一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该专利的基础培养基组成成分为：脑心浸液、乳清蛋白水解物、PPLO肉汤、酵母浸粉、示蛋白胨、硫代硫酸钠、Hank’s液、丙酮酸钠、0.1％酚红溶液、青霉素和去离子水，以使用前加入140～200ml的健康马血清，并需要再加入琼脂。根据其公开的内容，用该专利的培养基培养的猪肺炎支原体培养基活菌滴度可达1×109CCU/ml～1×1010CCU/ml,并且具有支原体生长速度快、分离的敏感性强,制备方法工艺简单，可操作性强，适合工业化大生产的特点。中国专利技术专利申请2015100244778公开的一种山羊支原体山羊肺炎亚种体外培养基由：PPLO肉汤21g/L，葡萄糖2g/L，丙酮酸钠2g/L，质量体积比25%的酵母浸液100ml/L，0.4%的酚红0.18ml/L，灭活马血清100mL/L，及水溶解的青霉素200IU/ml构成，其pH值为7.4～7.6。采用该培养基培养山羊支原体山羊肺炎亚种，56小时生长滴度可达到4×109ccu，在达到原有培养基生长滴度的同时，培养时间缩短10小时，同时可以降低培养基的成本。但由于上述专利用于培养猪肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种，培养牛支原体时活菌滴度均不高于109CCU/ml，此外，上述专利所需马血清量较大，血清含量均在10%～20%左右；因此，现阶段研究一种能高效培养牛支原体且可以使用更少血清的培养基，已成为牛支原体疫苗研究和生产中急需解决的重要问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有技术不足的牛支原体培养基，本专利技术另一目的是提供该培养基的制备方法。本专利技术的牛支原体培养基由基础培养基和辅助培养基混合构成，其中每升的培养基内的基础培养基的组成为：（1）Friismediapremix22.0～25.0g（2）丙酮酸钠5.0～6.0g（3）葡萄糖6.0～8.0g（4）质量浓度为1%的酚红2.0～2.5ml（5）去离子水750ml；辅助培养基的组成为：（6）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液110～120ml（7）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺16～17ml（8）质量浓度为10%的L-半胱氨酸4.0～6.0ml（9）质量浓度为15%水解乳蛋白32.0-35.0ml（10）10mg/ml的转铁蛋白0.8～1.2ml（11）10mg/ml的胰岛素0.8～1.2ml（12）20万IU/ml的青霉素0.25ml（13）无菌马血清50ml培养基的pH值为7.2～7.4。本专利技术的牛支原体培养基制备方法是将基础培养基的组分逐一溶入750ml去离子水中，115℃高压灭菌20min后冷却至室温备用；将辅助培养基的各组分经用0.22微米滤膜滤过除菌，充分混合即得辅助培养基，再在无菌条件下，将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1MNaOH（4g溶于100ml去离子水）调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，分装，置4℃保存备用。本专利技术的牛支原体培养基在牛支原体疫苗抗原制备中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术的牛支原体培养基根据牛支原体的生长特性，通过对不同的碳源、氮源、蛋白质、无机盐等诸多营养组分的组合进行筛选，同时对培养基的pH值、渗透压、离子强度等进行了比较分析，研究出了适合培养牛支原体的培养基。该培养基中Friismediapremix为牛支原体生长提供基本营养；丙酮酸钠可作为牛支原体培养中的替代碳源；培养基中的葡萄糖为牛支原体生长提供能量；通过添加新鲜酵母浸出液，为牛支原体生长提供所需的氮源、维生素及微量元素等营养成分；添加L-谷氨酰胺可促进微生物代谢、促进蛋白质合成；添加L-半胱氨酸和水解乳蛋白为牛支原体生长提供合适的氨基酸；胰岛素不仅具有促进糖元与脂肪酸的合成，而且能促进蛋白质、脂类和RNA的合成；转铁蛋白是微生物获取微量元素的重要方式，具有促进胰岛素发挥作用；通过添加马血清，向支原体提供丰富的胆固醇和必需的饱和或不饱和脂肪酸；添加酚红作为pH值指示剂，可判断支原体的生长状况；通过添加青霉素可抑制杂菌生长，对支原体无抑制效果，可避免培养基污染和延长培养基保存时间；该培养基的配方中除基本成份外，在培养基中还添加了新鲜酵母浸出液、L-谷氨酰胺、水解乳蛋白、胰岛素、转铁蛋白和L-半胱氨酸，上述成分的添加既能减少血清用量，还明显提高了牛支原体的活菌滴度；经反复实验证实，未添加之前活菌滴度为107-108CCU/ml，添加之后活菌滴度可达1010CCU/ml。而本专利技术最大的优势在于培养牛支原体活菌滴度高和低血清含量，活菌滴度达1010CCU/ml，明显高于现有技术培养基（改良KM2培养基培养牛支原体活菌滴度为107CCU/ml，牛心汤培养基为108CCU/ml，改良Thiaucourt’s培养基为108～109CCU/ml）。此外，本专利技术培养基中血清含量仅为5%，为现有技术培养基血清含量的1/4～1/2，低血清培养基可减轻异源血清对牛体的过敏应激反应，提高了生物安全，同时提高了活菌滴度，降低了生产成本，为牛支原体优质疫苗的研制奠定了基础。具体实施方式实施例1：1、本专利技术培养基的制备：基础培养基：（1）Friismediapremix22.0g（2）丙酮酸钠5.0g（3）葡萄糖6.0g（4）质量浓度为1%的酚红2.0ml（5）去离子水750ml。辅助培养基：（6）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液110ml（7）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺17.0ml（8）质量浓度为10%的L-半胱氨酸5.0ml（9）质量浓度为15%的水解乳蛋白33.0ml（10）转铁蛋白（10mg/ml）1.0ml（11）胰岛素（10mg/ml）1.0ml（12）青霉素(20万IU\本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛支原体培养基，其组成中包括：丙酮酸钠、新鲜酵母浸出液、葡萄糖、酚红、去离子水、青霉素和少量马血清，其特征在于该培养基由基础培养基和辅助培养基混合构成，其中每升的培养基内的基础培养基的组成为：Friis media premix 22.0～25.0g丙酮酸钠 5.0～6.0g葡萄糖 6.0～8.0g质量浓度为1%的酚红 2.0～2.5ml去离子水750 ml；辅助培养基的组成为：质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 110～120ml（7）质量浓度为3%的L‑谷氨酰胺16～17 ml（8）质量浓度为10%的L‑半胱氨酸4.0～6.0 ml（9）质量浓度为15%的水解乳蛋白 32.0‑35.0 ml（10）10 mg/ml的转铁蛋白0.8～1.2 ml（11）10 mg/ml的胰岛素0.8～1.2 ml（12）20万IU/ml的青霉素0.25 ml（13）无菌马血清50 ml培养基的pH值为7.2～7.4。
【技术特征摘要】
1.一种牛支原体培养基，其组成中包括：丙酮酸钠、新鲜酵母浸出液、葡萄糖、酚红、去离子水、青霉素和少量马血清，其特征在于该培养基由基础培养基和辅助培养基混合构成，其中每升的培养基内的基础培养基的组成为：Friismediapremix22.0～25.0g丙酮酸钠5.0～6.0g葡萄糖6.0～8.0g质量浓度为1%的酚红2.0～2.5ml去离子水750ml；辅助培养基的组成为：质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液110～120ml（7）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺16～17ml（8）质量浓度为10%的L-半胱氨酸4.0～6.0ml（9）质量浓度为15%的水解乳蛋白32.0-35.0ml（10）10mg/ml的转铁蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈胜利，储岳峰，郝华芳，赵萍，刘永生，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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