本发明专利技术涉及基于高通量测序检测人循环肿瘤DNA EGFR基因的捕获探针及试剂盒。本发明专利技术的人循环肿瘤DNA EGFR基因捕获探针是多种探针的混合物，所述多种探针分别能够捕获人EGFR基因上不同的目标区域。在优选的实施方案中，所述多种探针的集合能够捕获人循环肿瘤DNA EGFR基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域。
【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种基于高通量测序检测人循环肿瘤DNAEGFR基因的捕获的探针及试剂盒。
技术介绍
在血液中存在着游离的小片段DNA(cell-freeDNA，cfDNA)，它们来自死亡的细胞。通常死亡的细胞会被清除掉，因此cfDNA的含量是非常低的，通常一个健康人的1ml血浆中含25ngcfDNA。而癌症患者的cfDNA的含量高出正常几倍，其中一部分是ctDNA(circulatingtumorDNA)。ctDNA的相对含量与肿瘤的负荷和对治疗的反应是相关的，可用于鉴定驱动基因、指导临床治疗、监测临床治疗效果及癌症复发、揭示治疗抗性以及检测疾病进展。在有些方面ctDNA方法的灵敏度甚至高传统的手段。例如，与传统的影像学检测相比，追踪早期乳腺癌患者术后血液中的肿瘤DNA，可以提前7.9个月发现乳腺癌复发。在肺癌中检测cfDNA的EGFR突变对肺癌也有着重要的诊断价值。ctDNA在癌症早期就可以被检测到。因为cfDNA容易收集，在肺癌中已显示与组织中的变异高度一致，因此ctDNA的液体活检越来越受到关注。血液中ctDNA含量，在癌症早期占cfDNA的比例是非常低，通常小于0.1％。ctDNA检测方法很多，如用数字化PCR(DigitalPCR)，或下一代测序(NextGenerationSequencing,NGS)等。通过NGS优化ctDNA的深度测序(CAPP-seq)使突变检测的敏感度达到0.02％，特异性为100％。此方法结合降低背景噪声的iDES(integratedDigitalErrorSuppression)分析方法后，使检测频率的阈值进一步下降到0.004％。从而大大提高了分析CtDNA的检出率。肺癌(lungcancer)是全球范围内最普遍和最致命的恶性肿瘤，5年生存率仅为17％左右，每年造成160万人的死亡。在中国吸烟和环境污染是两个最主要的肺癌致病因素。据统计2015年在中国有60万肺癌患者死亡，新增73万例。并有增长趋势，到2025年可能造成100万人死亡。肺癌根据组织病理学分类分为小细胞肺癌(small-celllungcarcinomas,SCLC)与非小细胞肺癌(no-small-celllungcarcinomas,NSCLC)，非小细胞肺癌又分为肺腺癌(adenocarcinomas)、鳞状细胞癌(squamouscellcarcinomas)和大细胞肺癌(large-cellcarcinomas)。比例最大的是肺腺癌，占40％，其次为占30％的鳞状细胞癌，大细胞肺癌和小细胞肺癌各占15％。全身性化疗一直是肺癌的主要治疗方式，缺乏特异性，副作用大。随着在NSCLC中一些重要基因变异的发现，针对这些基因变异的靶向药物被研制出来并已用于临床治疗。如吉非替尼是针对EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)变异的NSCLC靶向治疗药物。EGFR在细胞信号转导中起着重要作用，一旦被激活，可导致肿瘤细胞内酪氨酸蛋白激酶活化和自身的磷酸化，从而使细胞增生、转移、血管生成和细胞凋亡的抑制。EGFRexon19缺失和L858R突变激活EGFR，使对EGFR的抑制剂药物更敏感。在亚洲人中约50％NSCLC中含有EGFR，并且90％是上述激活型的突变。因此EGFR突变的鉴定对治疗NSCLC有着非常重要的作用。通过对人循环肿瘤DNAEGFR基因的检测可筛检出肺癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗。耗资30亿美元历时10余年完成的人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP)给基因组学研究带来了天翻地覆的变化，通过测定人类基因组DNA的序列，探寻基因在染色体上的位置，明确基因的结构和功能，解读人类的全部遗传信息，人类第一次在分子水平上全面认识自我。在这期间，建立了两项非常重要的高通量技术：基因芯片和第二代测序技术。这两种技术进一步结合，就产生了一种新的解决方案：目标序列捕获测序技术。目标序列捕获是指通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定区域。一种重要的方法是根据核酸分子碱基互补杂交原理设计与目的区域互补的探针序列，而根据杂交时状态不同，目标序列捕获可以分为固相杂交法和液相杂交法。液相杂交是通过在溶液中，目标DNA片段和已带有生物素标记探针直接杂交，然后通过生物素亲和素反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上。洗去非目标DNA，洗脱后，富集的DNA用于测序。相较于固相杂交，液相杂交具有操作简便、易于自动化等优点。常规的探针设计方式为探针间首尾相连，且不存在重叠部分，这样做的缺点是在基因文库中EGFR基因多数片段只能被单一探针捕获，且探针交界处的捕获效果差，造成捕获效率偏低。同时，常规探针设计方式对探针长度和Tm值无特殊要求，这就导致探针间差异较大，在相同的实验条件下绝大多数探针不能同时达到最佳的捕获效果。本专利技术基于CAPP-seq和数字信号技术，设计EGFR探针检测血液cfDNA中EGFR的变异。当测序深度达到10000×时，有效深度可达5000×，检测突变的敏感性达到0.02％。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于高通量测序检测人循环肿瘤DNAEGFR基因的捕获探针及试剂盒。本专利技术的人循环肿瘤DNAEGFR捕获探针是多条探针的混合物，所述多条探针分别能够捕获人EGFR基因上不同的目标区域。在优选的实施方案中，所述多条探针的集合能够捕获人循环肿瘤DNAEGFR基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域，减少非特异性捕获，同时杂交温度相近。根据本专利技术的一个方面，提供用于人循环肿瘤DNAEGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针，所述捕获探针为多条探针的混合物；所述多条探针能覆盖全部目标区域；所述多条探针之间存在重叠区，使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖；所述多条探针的长度均为90-130bp；所述多条探针的Tm值在65-75℃之间。本专利技术中，目标区域是指包含人EGFR基因上的任何一个或多个变异的区域。本专利技术中，全部目标区域优选为人EGFR基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域。根据本专利技术的一个方面，提供用于人人循环肿瘤DNAEGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针混合物，所述捕获探针混合物至少包括具有SEQIDNO:1-132所示序列的132条探针。在一些实施方案中，所述捕获探针混合物由具有SEQIDNO:1-132所示序列的132条探针组成。在另一些实施方案中，所述捕获探针混合物还进一步包括一条或更多条具有选自SEQIDNO:133-195的序列的探针。在预选的实施方案中，所述捕获探针混合物为SEQIDNO:1-195所示的195条探针的混合物。在一些优选的实施方案中，捕获探针混合物中包含的探针按相同比例混合在一起。优选地，本专利技术的捕获探针混合物中每条探针均具有标记，优选为生物素标记。本专利技术的捕获探针混合物的工作浓度是0.1PM～6PM，优选1.5PM；其中PM＝皮摩尔/升。根据本专利技术的另一个方面，提供人循环肿瘤DNAEGFR基因变异检测试剂盒，其中包含上述探针混合物。本专利技术的人循环肿瘤DNAEGFR基因变异检测试剂盒还可以包含用于人EGFR基因变异的高通量测序检测的任何本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针，所述捕获探针为多条探针的混合物；所述多条探针能覆盖全部目标区域；所述多条探针之间存在重叠区，使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖；所述多条探针的长度均为90‑130bp；所述多条探针的Tm值在65‑75℃之间。
【技术特征摘要】
1.用于人循环肿瘤DNAEGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针，所述捕获探针为多条探针的混合物；所述多条探针能覆盖全部目标区域；所述多条探针之间存在重叠区，使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖；所述多条探针的长度均为90-130bp；所述多条探针的Tm值在65-75℃之间。2.权利要求1的捕获探针，所述捕获探针至少包括具有SEQIDNO:1-132所示序列的132条探针。3.权利要求2的捕获探针，所述捕获探针由具有SEQIDNO:1-132所示序列的132条探针组成。4.权利要求2的捕获探针，所述捕获探针还包括一条或更多条具有选自SEQIDNO:133-195的序列的探针。5.权利要求4的捕获探针，所述捕获探针为SEQIDNO:1-195所示的195条探针的混合物：6.权利要求2-5任一项的捕获探针，其中混合物中包含的探针按相同比例混合在一起。7.权利要求1-6任一项的捕获探针，其中每条探针均具有生物素标...
【专利技术属性】
技术研发人员：李福根，熊磊，金其煌，覃灏，
申请(专利权)人：埃提斯生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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