表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHOH及构建方法技术

本发明专利技术属于分子生物学和生物技术领域的重组病毒载体疫苗，具体涉及一种表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHOH及构建方法。所述重组火鸡疱疹病毒株rHOH，其保藏号是CGMCC NO.12985。所述的重组火鸡疱疹病毒株rHOH，它的gB启动子来源于火鸡疱疹病毒载体FC126自身；表达的外源抗原(血凝素蛋白)基因经Gallus Gallus的密码子偏嗜性优化，核苷酸的序列发生改变，但不改任何变氨基酸序列。该重组火鸡疱疹病毒株rHOH可用于制备预防H7N9亚型禽流感病毒的疫苗；接种孵化后第18日龄的鸡胚或1日龄的雏鸡，预防和控制家禽的H7N9疫情，保护公众卫生和安全。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和生物
的重组病毒载体疫苗，具体涉及一种能够表达具H7N9亚型禽流感病毒(AvianInfluenzavirus,AIV)血凝素HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)，该重组病毒可用于免疫家禽预防H7N9亚型禽流感病毒中的用途。
技术介绍
感染人的H7N9亚型禽流感于2013年首次爆发我国华东的长三角地区，是一株三源重组的新型禽流感病毒，对家禽不致病或低致病性。截止目前已经扩散至全国除西藏和内蒙古自治区外的所有地区，珠江三角区是继长三角地区后的又一新的爆发疫源地。根据WHO的统计显示，截止到2016年6月13日，一共有781例人感染H7N9的案例，其中死亡313人，死亡率在40％左右。根据flutracters的追踪报道，截止到2016年7月，H7N9感染人的案例已经突破800。其增长速度直逼自从2003年以来人感染H5亚型禽流感数量已经高达851例，由此可见人感染H7N9的数量增长势头迅猛，对公共卫生的危害不容小觑。由于家禽感染不发病，感染的病例多有与活期接触的流行病史，因此，活禽市场的家禽的H7N9疫情状态具有直接对公共卫生健康的影响巨大。并且人感染H7N9的高峰季节也与家禽的流行规律息息相关。然而目前临床尚无针对H7N9的家禽疫苗用于防控此类疾病，因此亟需研制新型的疫苗来保护家禽，降低疫情对公共的危害。火鸡疱疹病毒(HerpesvirusofTurkey,HVT)是一种典型无致病性的α疱疹病毒。因HVT与鸡马立克病毒(Marek'sdiseasevirus，MDV)在遗传学和血清学上具有相关性，自1970年以来，HVTFc-126株作为MD疫苗被广泛使用。该疫苗具有不会引发致瘤发生、保护效果良好、在体内持续存在、可以冻干、便于储存和运输等诸多优点，在MD的防控过程中发挥了重要的作用。近年来，HVT作为病毒载体方面的研究取得了许多进展，因HVT与其它禽病毒载体相比具有许多独特优势，包括：HVT对鸡及其他动物无致病性，安全性好；可以在动物体内持续存在、有利于外源基因的持续表达、刺激机体产生较高的抗体水平；HVT可引起高强度的细胞介导的免疫反应、免疫出现早、持续时间长、接种一次可达到终生免疫；HVT重组疫苗具有生产成本低、可以冻干、易于贮存和运输；HVT具有很强的细胞结合特性、病毒于细胞间传播、因此作为重组疫苗，可以突破母源抗体的干扰等[Bublot,M.,etal.,Useofavectoredvaccineagainstinfectiousbursaldiseaseofchickensinthefaceofhigh-titredmaternallyderivedantibody.JCompPathol,2007.137Suppl1:p.S81-4.]。目前，传染性法氏囊病毒等多种禽病保护性抗原均已在HVT载体中成功表达[Tsukamoto,K.,etal.,Complete,Long-LastingProtectionagainstLethalInfectiousBursalDiseaseVirusChallengebyaSingleVaccinationwithanAvianHerpesvirusVectorExpressingVP2Antigens.JournalofVirology,2002.76(11):p.5637-5645.]。应用上述水平制备的VaxxitexRHVT+IBD重组疫苗已经获得生产许可，成为商品化的以疱疹病毒为载体的动物源性疫苗，使HVT成为最具有开发前景的病毒载体。其技术核心利用同源重组原理：通过外源基因两侧的非必需区同源臂与HVT基因组相对应区段进行同源交换，从而将外源基因导入基因组中。1992年Morgan等人首次利用同源重组方法构建了表达NDV(F)基因的重组HVT，该重组病毒既能抵抗致死性MDV的攻击，又能预防新城疫，其保护率接近传统疫苗的保护效果[Morgan,R.W.,etal.,ProtectionofchickensfromNewcastleandMarek'sdiseaseswitharecombinantherpesvirusofturkeysvaccineexpressingtheNewcastlediseasevirusfusionprotein.AvianDis,1992.36(4):p.858-70.]。后来，Gao等人使用上述方法将AIVH5N1(HA)基因插入到HVT基因组不同的位置中，构建了两株rHVT重组病毒，疫苗试验表明这两株重组病毒均可以同时抵抗AI和MD[Gao,H.,etal.,ExpressionofHAofHPAIH5N1VirusatUS2GeneInsertionSiteofTurkeyHerpesvirusInducedBetterProtectionthanThatatUS10GeneInsertionSite.PLoSONE,2011.6(7):p.e22549.]。内源性启动子具有克服针对抗原的母源抗体干扰作用。MDV基因的转录和翻译，是受到严格调控的。如当病毒感染细胞时，病毒基因的表达分为3个时期：立即早期、迟早期和晚期。但是，以MDV构建重组病毒时，异源的强启动子受到病毒的调控较少，在重组病毒免疫的早期，该启动子所控制地保护抗原基因大量表达，与机体中针对该抗原的母源抗体发生反应，使得针对该抗原的母源抗体下降，从而降低了机体对某种疾病的早期保护。Sonoda等(Sonoda,Kengo,etal.\DevelopmentofaneffectivepolyvalentvaccineagainstbothMarek'sandNewcastlediseasesbasedonrecombinantMarek'sdiseasevirustype1incommercialchickenswithmaternalantibodies.\Journalofvirology74.7(2000):3217-3226.)利用MDVI型自身的gB启动子构建重组病毒，表达NDV的F基因，免疫商品鸡，可以提供100％的保护，同时，并不影响重组病毒的稳定性。因此，进一步证实了MDVI型自身的gB启动子受到严格地调控，可以避免母源抗体的干扰，保证了免疫保护力。影响外源基因表达水平的因素很多，而密码子的选择是其中重要的参数之一，基因表达水平与嗜好密码子的使用程度之间存在强的相关性。每个氨基酸平均有三个对应密码子，这使得不同的核苷酸序列可以编码出相同的氨基酸序列，而编码同一氨基酸的不同的密码子在不同的生物和不同基因中的使用频率有着显著的差异，这与在细胞中相应的tRNA的浓度是呈正相关的。使用频率极低的就是该物种或基因的稀有密码子，稀有密码子的使用已经被证实为阻碍基因表达的一个重要因素，因此去除稀有密码子能够显著提高一个基因的翻译速度。每个物种都有对应的偏嗜密码子，因此为了提高外源基因在一个物种体内的翻译和表达水平，常常对外源基因密码子进行改造，使之符合该物种的密码子偏嗜分布。Jiang(Jiang,Yongping,etal.\EnhancedprotectiveefficacyofH5subtyp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHOH，其保藏号是CGMCC NO.12985。

【技术特征摘要】
1.一种表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHOH，其保藏号是CGMCCNO.12985。2.根据权利要求1所述的表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHOH，其特征在于该毒株中重组火鸡疱疹病毒的gB启动子来源于火鸡疱疹病毒载体FC126；表达的H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白基因经GallusGallus的密码子偏嗜性优化，序列如SEQIDNO:1。3.一种表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的HVT重组病毒株rHOH的构建方法，该方法包括以下步骤：(1)先获得密码子优化过的OHA和HVT的gB(HgB)启动子，在带有同源臂的pCMGFP上的EcoRV、NheI与Kpn2I...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀梵，何东昌，郝小利，顾敏，胡娇，王晓泉，刘晓文，胡顺林，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32