一种InDel位点基因型分型的方法技术

本发明专利技术提供了一种InDel位点基因型分型的方法，包括以下步骤：1)将目的基因DNA序列进行T载体克隆测序，得到目的基因克隆产物序列，将所述目的基因克隆产物序列进行多重比对，得到InDel位点；2)根据所述InDel位点设计PCR扩增引物，所述PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用荧光基团修饰；3)用所述PCR扩增引物对待测样本DNA进行PCR扩增获得扩增产物，用毛细管荧光凝胶电泳检测扩增产物确定所述待测样本中InDel位点的基因型。本发明专利技术提供的基因型分型方法，成本低、操作简单灵活、结果准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种InDel位点基因型分型的方法。
技术介绍
插入缺失(InsertionandDeletion，简称InDel)是指同源序列的比对中出现的至少1bp核苷酸的差异，这种差异称为InDels；InDel在基因组中的含量仅次于单核苷酸多态性(SNP)标记，具有数量多、分布广泛、变异丰富等特点。根据基因组中插入缺失位点，设计扩增这些插入缺失位点的PCR引物，产生的多态性位点即为插入缺失(InDel)标记。插入缺失(InDel)标记在系统发育推断、遗传诊断、药物设计等方面具有重要的应用潜力。目前，常用的InDel分型方法主要是测序法和芯片法，测序法和芯片法实验操作繁琐、效率较低并且依赖相关大型仪器平台作为支撑，费用昂贵。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种成本低、操作简单灵活、准确的基因型分型的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种InDel位点基因型分型的方法，包括以下步骤：1)将目的基因DNA序列进行T载体克隆测序，得到目的基因克隆产物序列，将所述目的基因克隆产物序列进行多重比对，得到InDel位点；2)根据所述InDel位点设计PCR扩增引物，所述PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用荧光基团修饰；3)用所述PCR扩增引物对待测样本全基因组DNA进行PCR扩增获得扩增产物，用毛细管荧光凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中有两条条带则该InDel位点的基因型为杂合型ID；若有一条条带且片段大小与杂合型ID中大的片段相同，则该InDel位点基因型为插入纯合型II；若有一条条带且片段大小与杂合型ID中小的片段相同，则表示该InDel位点为缺失纯合型DD。优选的，所述荧光基团为FAM或HEX。优选的，所述多重比对采用MEGA软件中的ClustalW模块。优选的，所述待测样本为杨木树种。优选的，所述目的基因为尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1。优选的，所述尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1上的InDel位点分别为InDel1、InDel2、InDel3、InDel4和InDel5；所述InDel1位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1全长第401bp到409bp处，所述InDel2位于第1399bp到1401bp处，InDel3位于第1427bp到1438bp，InDel4位于第2094bp到2103bp处，InDel5位于第4143bp到4152bp。优选的，根据InDel1设计的引物为正向引物SEQIDNO.1和反向引物SEQIDNO.2；根据InDel2和InDel3设计的引物为正向引物SEQIDNO.3和反向引物SEQIDNO.4；根据InDel4设计的引物为正向引物SEQIDNO.5和反向引物SEQIDNO.6；根据InDel5设计的引物为正向引物SEQIDNO.7和反向引物SEQIDNO.8。优选的，步骤3)中所述PCR扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53～57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。优选的，所述PCR扩增用扩增体系包括以下组分：0.7μl的待测样品全基因组DNA，0.15μl的0.8UTaq酶，0.3μl0.2mM的dNTPs，0.9μl25mM的MgCl2，1.25μl的10×PCRbuffer，0.4μl100nmolL-1的正向引物和0.4μl100nmolL-1反向引物和8.4μl的ddH2O。优选的，所述基因组DNA的浓度为5～20ng/μl。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的InDel位点基因型分型的方法通过多重比对获得目的基因InDel位点，根据InDel位点设计PCR扩增引物，包括正向引物和反向引物，采用荧光基团修饰正向引物的5’端，然后对待测样本DNA进行PCR扩增，用毛细管荧光凝胶电泳检测扩增产物确定所述待测样本中InDel位点的基因型。本专利技术对引物组中的正向引物5'末端采用荧光基团进行修饰，可显著地保留荧光信号强度、减少InDel位点的非特异性扩增，提高了基因型检测的准确度；同时极大地简化了实验步骤和配套条件，并显著地降低了实验成本。进一步的，在适宜退火温度和PCR反应条件下，进一步提高荧光信号强度，提高基因型检测的准确度。附图说明图1为实施例1中毛细管荧光凝胶电泳结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种InDel位点基因型分型的方法，包括以下步骤：1)将目的基因DNA序列进行T载体克隆测序，得到目的基因克隆产物序列，将所述目的基因克隆产物序列进行多重比对，得到InDel位点；2)根据所述InDel位点设计PCR扩增引物，所述PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用荧光基团修饰；3)用所述PCR扩增引物对待测样本DNA进行PCR扩增获得扩增产物，毛细管荧光凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中有两条目的条带则该InDel位点的基因型为杂合型ID；若有一条目的条带且片段大小与杂合型ID中大的片段相同，则该InDel位点基因型为插入纯合型II；若有一条目的条带且片段大小与杂合型ID中小的片段相同，则表示该InDel位点为缺失纯合型DD。本专利技术提供的InDel位点基因型分型的方法适用于林木树种，优选的为杨木树种，如本专利技术的实施例中所用毛白杨。本专利技术将目的基因DNA序列进行T载体克隆测序，得到目的基因克隆产物序列。本专利技术中所述的目的基因为待测样品的任一基因，优选的为尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1，优选的所述尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1的序列如SEQIDNO.9所示。在本专利技术选定目的基因后，将所述目的基因DNA序列进行T载体克隆测序，得到目的基因克隆产物序列。本专利技术对所述的T载体克隆测序的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的T载体转化大肠杆菌DH52感受态细胞克隆测序方法步骤即可。得到目的基因克隆产物序列后，本专利技术将所述目的基因克隆产物序列进行多重比对，得到InDel位点。在本专利技术中，所述的多重比对优选的采用MEGA软件中的ClustalW模块，具体的多重比对的参数优选的为软件模块中的默认参数。具体的在本专利技术实施例中以尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1为目的基因，对目的基因进行T载体克隆测序，后采用MEGA软件中的ClustalW模块进行多重比对，确定的InDel位点有5个，分别为InDel1、InDel2、InDel3、InDel4和InDel5；所述InDel1位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1全长第401bp到409bp处，所述InDel2位于第1399bp到1401bp处，InDel3位于第1427bp到1438bp，InDel4位于第2094bp到2103bp处，InDel5位于第4143bp到4152bp。本专利技术在获得上述InDel位点后，分别根据上述InDel位点设计引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用荧光基团修饰。优选的根据InDel1设计的引物为正向引物SEQIDNO.1和反向引物SEQIDNO.2；正向引物的序列为UXS1ID1F:5'-CTCCCGCCTTAACCCATCT-3'；反向引物的序列为UXS1ID1R:5'-GTAACCACGATACGCAAACTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种InDel位点基因型分型的方法，包括以下步骤：1)将目的基因DNA序列进行T载体克隆测序，得到目的基因克隆产物序列，将所述目的基因克隆产物序列进行多重比对，得到InDel位点；2)根据所述InDel位点设计PCR扩增引物，所述PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用荧光基团修饰；3)用所述PCR扩增引物对待测样本全基因组DNA进行PCR扩增获得扩增产物，用毛细管荧光凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中有两条条带则该InDel位点的基因型为杂合型ID；若有一条条带且片段大小与杂合型ID中大的片段相同，则该InDel位点基因型为插入纯合型II；若有一条条带且片段大小与杂合型ID中小的片段相同，则表示该InDel位点为缺失纯合型DD。

【技术特征摘要】
1.一种InDel位点基因型分型的方法，包括以下步骤：1)将目的基因DNA序列进行T载体克隆测序，得到目的基因克隆产物序列，将所述目的基因克隆产物序列进行多重比对，得到InDel位点；2)根据所述InDel位点设计PCR扩增引物，所述PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用荧光基团修饰；3)用所述PCR扩增引物对待测样本全基因组DNA进行PCR扩增获得扩增产物，用毛细管荧光凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中有两条条带则该InDel位点的基因型为杂合型ID；若有一条条带且片段大小与杂合型ID中大的片段相同，则该InDel位点基因型为插入纯合型II；若有一条条带且片段大小与杂合型ID中小的片段相同，则表示该InDel位点为缺失纯合型DD。2.根据权利要求1所述InDel位点基因型分型的方法，其特征在于，所述荧光基团为FAM或HEX。3.根据权利要求1所述InDel位点基因型分型的方法，其特征在于，所述多重比对采用MEGA软件中的ClustalW模块。4.根据权利要求1所述InDel位点基因型分型的方法，其特征在于，所述待测样本为杨木树种。5.根据权利要求1或4所述InDel位点基因型分型的方法，其特征在于，所述目的基因为尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1。6.根据权利要求5所述InDel位点基因型分型的方法，其特征在于，所述尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1上的InDel位点分别为InDel1、InDel2、InDel3、InDel4和InDel5；所述InDel1位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶基因1全长第401b...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德强，巩琛锐，杜庆章，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11