高效液相色谱-串联质谱内标法同时检测葡萄酒和/或果酒中四种有机酸的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种高效液相色谱‑串联质谱内标法检测葡萄酒和/或果酒中有机酸的方法与应用，属于有机酸检测及应用领域。将高效液相色谱与质谱联用，优化色谱与质谱检测条件，将葡萄酒或果酒简单处理后直接进样测定，能够定量检测出酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等有机酸的含量。该检测有机酸的方法检出限低，选择性好，前处理简单快速，过程无损失，检测灵敏度高，结果准确可靠，可实现对4种有机酸快速准确的测定，为快速鉴别勾兑假葡萄酒及果酒、保护消费者的餐桌安全及维护酒类市场健康发展提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于高效液相色谱-串联质谱内标法同时检测葡萄酒和/或果酒中四种有机酸的方法，属于有机酸检测与应用

技术介绍
随着我国经济的快速发展与生活水平的提高，有着悠久历史和文化底蕴的葡萄酒与果酒越来越受到人们的喜爱，走上了老百姓的日常餐桌。其通过对人体内酸碱平衡的调节，使各种酶的生理活性得以实现，从而促进体内新陈代谢的正常进行，有利于饮用者的身体健康。但是，目前市场上有不法商贩见有利可图，利用食用色素、食用酒精、甜味剂等原料勾兑制作假酒，从外观看该类假酒豪华高端大气且价格很高，可一瓶成本仅为几元，且过量摄入食用色素或甜味剂会增加肝脏负担而损害消费者的身体健康。因此，为保护消费者的餐桌安全与维护葡萄酒与果酒市场的健康发展，建立一种快速鉴别勾兑假葡萄酒与果酒的方法具有重要的意义。葡萄酒与果酒中的成分相当复杂，其中有机酸是重要成分，是影响葡萄酒与果酒的风味及酒品的质量的重要因素，也是鉴别产品质量的重要指标之一。高质量葡萄酒与果酒的有机酸种类与含量主要受到发酵作用的影响，整个发酵过程中有多达几十种有机酸参与反应，含量最高的四种酸为酒石酸(tartaricacid，含量1.5～2.5g/L)、苹果酸(malicacid，含量1.5～3.0g/L)、琥珀酸(succinicacid，含量0.6～1.5g/L)和柠檬酸(citricacid，含量0.10～0.15g/L)。造假者为了保持葡萄酒及果酒的风味与口感，通常仅加入大量的柠檬酸进行勾兑。因此，在国家标准《葡萄酒》(GB15037-2006)、《山葡萄酒》(GB/T27586-2011)中均规定了柠檬酸的最大含量。由于勾兑葡萄酒中并不含酒石酸、苹果酸和琥珀酸这三种物质，因此，对这三种成分的检测能够辅助判断勾兑葡萄酒或果酒。关于有机酸的检测有多种方法，在食品领域，除高效液相色谱法外，还有薄层色谱法、气相色谱法、气质色谱联用法、毛细管电泳法和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等。薄层色谱法精确度较差，只能定性或者半定量；气相色谱法与气质色谱联用法的前处理需要通过酯化的方法将有机酸进行衍生，步骤复杂繁琐；毛细管电泳技术法灵敏度低，重现性较差。在《葡萄酒、果酒通用分析方法》(GB/T15038-2006)中规定了利用高效液相色谱技术测定有机酸的方法，但该方法的前处理过程中要进行固相萃取柱的活化、洗脱并收集样品，甚为繁琐，且酒中的色素还会干扰有机酸的检测，准确度低。以上分析方法的缺点，如前处理过程繁琐、精确度和灵敏度差和不能完全定量的问题等，限制了这些方法在检测葡萄酒与果酒中有机酸中的应用。此外，虽然HPLC-MS/MS法可用于测定果蔬中有机酸，但是利用HPLC-MS/MS法测定葡萄酒和/或果酒中有机酸的方法未见报道。因此，建立一种简单、快速、准确检测葡萄酒和/或果酒中有机酸的方法，对于鉴别勾兑假葡萄酒与果酒具有重要的实用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述问题，提供一种利用高效液相色谱串联质谱方法同时测定葡萄酒和/或果酒中四种有机酸的方法。该方法前处理简单、检出限低、选择性好、便捷、灵敏度和准确度高，能够快速检测葡萄酒和/或果酒中4种有机酸，鉴别勾兑假葡萄酒或果酒，对保护消费者的餐桌安全具有重要的应用价值与实际意义。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术公开了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)内标法在检测葡萄酒和/或果酒中有机酸的应用。一种高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)内标法同时检测葡萄酒和/或果酒中四种有机酸的方法，所述四种有机酸是酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸。优选的，所述内标法采用川楝素为内标物，本研究发现以川楝素作为内标，其对四种有机酸无干扰。进一步的，所述方法包括以下步骤：(1)制备4种有机酸标准溶液并进行高效液相色谱串联质谱测定；(2)确定4种有机酸的线性关系及检出限和定量限；(3)预处理葡萄酒和/或果酒样品并进行测定；(4)根据样品检测数据计算出4种有机酸的含量。优选的，步骤(1)或(3)的色谱测定条件为：选用AgilentEclipseplusC18(50×4.6mm，1.8μm)色谱柱，此色谱柱分离效果好，各化合物达到了基线分离，且由于该柱较短，化合物流出较快，保留时间短，较为理想；流动相：A相为0.15％甲酸水溶液，B相为乙腈，A相水溶液中甲酸的加入调节了酸度，有利于有机酸的分离；梯度洗脱程序：梯度洗脱：0～2.0min，A相100％；2.0-2.1min，A相100％→50％，B相0→50％；2.1-5.0min，A相与B相各50％；5.0-5.1min，A相50％→0；最后平衡4.9min；流速：0.6mL/min；柱温：20℃。串联质谱测定条件为：电离模式：电喷雾离子源(ESI)，采集模式：负离子多反应监测(MRM)模式，干燥气：高纯N2，干燥气温度：200-350℃，干燥气流速：12L/min，雾化压力：30psi，毛细管电压：4000V。优选的，目标组分MRM模式下质谱分析参数如下：进一步的，所述步骤(1)具体包括以下步骤：精确配制一系列至少6种不同质量浓度的的酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸标准工作溶液，加入内标物标准溶液，进样测定得到标准谱图。进一步的，步骤(2)具体包括：将步骤(1)获得的标准谱图分别以4种有机酸与内标物的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归，得到线性关系回归方程、相关系数和线性范围；以信噪比(S/N)≥3对应的浓度为检出限，(S/N)≥10对应的浓度作为定量限。进一步的，步骤(3)具体为：准确量取葡萄酒和/或果酒样品稀释，过滤，进样测定得到样品谱图。进一步的，所述步骤(4)具体为：将步骤(3)得到的样品谱图与标准谱图对比，定性确定有机酸的种类，同时代入线性方程定量计算有机酸的含量。一种高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)快速检测葡萄酒和/或果酒中4种有机酸的方法在鉴别勾兑葡萄酒与果酒的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术首次利用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)方法检测葡萄酒和/或果酒及其酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸4种有机酸。通过优化色谱和质谱检测条件，使4种有机酸从色谱柱中流出快，保留时间短，实现4种酸的快速分离，且得到的色谱峰对称，提高了检测的灵敏度与准确度；且该方法对4种酸的检测具有较高的选择性，检出限与定量限均远低于葡萄酒或果酒中4种酸的含量，能够测定低浓度的有机酸含量，具有检测限低、能够定性定量准确的检测的优点。利用建立起的HPLC-MS/MS检测葡萄酒和/或果酒中4种有机酸的技术定性和定量检测葡萄酒和/或果酒中4种有机酸，可以鉴别勾兑葡萄酒或果酒。通过加入内标消除了基质效应的影响，同时检测4种有机酸能够相互辅助鉴别勾兑葡萄酒或果酒，使检测结果更加精确，并且由于HPLC-MS/MS技术采用“双离子对”进行定性定量，避免了内源性物质的干扰与出现假阳性判定结果的可能性。该方法前处理简单快速，过程无损失，检测灵敏度高，结果准确可靠，实现了6分钟内完成4种有机酸的准确测定，为快速鉴别勾兑假葡萄酒及果酒、保护消费者的餐桌安全及维护酒类市本文档来自技高网...

【技术保护点】
高效液相色谱‑串联质谱内标法在检测葡萄酒和/或果酒中有机酸的应用。

【技术特征摘要】
1.高效液相色谱-串联质谱内标法在检测葡萄酒和/或果酒中有机酸的应用。2.一种高效液相色谱-串联质谱内标法检测葡萄酒和/或果酒中酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸4种有机酸的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)制备4种有机酸标准溶液并进行高效液相色谱串联质谱检测；(2)确定4种有机酸的线性关系及检出限和定量限；(3)预处理葡萄酒和/或果酒样品并进行测定；(4)根据样品检测数据计算出4种有机酸的含量。3.如权利要求2所述的一种高效液相色谱-串联质谱内标法在检测葡萄酒和/或果酒中4种有机酸的方法，其特征是，所述内标法采用川楝素为内标物。4.如权利要求2所述的一种高效液相色谱-串联质谱内标法在检测葡萄酒和/或果酒中4种有机酸的方法，其特征是，步骤(1)或(3)的色谱测定条件为：色谱柱：AgilentEclipseplusC18，50×4.6mm，1.8μm；流动相A为含0.15％甲酸的水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：梯度洗脱：0～2.0min，A相100％；2.0-2.1min，A相100％→50％，B相0→50％；2.1-5.0min，A相与B相各50％；5.0-5.1min，A相50％→0；最后平衡4.9min；流速0.6mL/min；柱温：20℃。5.如权利要求2所述的一种高效液相色谱-串联质谱内标法在检测葡萄酒和/或果酒中4种有机酸的方法，其特征是，质谱测定条件为：电离模式：电喷雾离子源，采集模式：负离子多反应监测模式...

【专利技术属性】
技术研发人员：苑金鹏，刘建华，徐清忠，王珊珊，李赛钰，赵金，宁凡盛，
申请(专利权)人：山东省分析测试中心，
类型：发明
国别省市：山东;37