用于表征脂蛋白的方法技术

用于表征样品中的脂蛋白的体外方法，其包括获得所述样品的2D扩散‑排序1H NMR谱以及使用多个模型函数进行对应于甲基信号之谱部分的曲面拟合，每个模型函数对应于与脂蛋白级分和亚类相关联的给定颗粒尺寸并且包括至少一个在所述拟合期间待估算的模型参数，估算的模型参数为模型参数组，为此使NMR信号和作为所述模型函数之线性组合而建立的模型信号之间的差异最小化，其中每个模型函数为洛伦兹函数的三元组。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术目的本专利技术涉及用于表征脂蛋白的方法，并且适用于生物医学领域。现有技术脂质在血液中主要以脂蛋白的形式存在，脂蛋白是在肝和肠中合成的运输胆固醇、甘油三酯及其他脂质通过血流进入外周组织的颗粒。血脂的异常水平可指示心血管疾病。为了评估心血管风险，一般使用标准脂质组，其包括血浆甘油三酯、总胆固醇、LDL胆固醇和HDL胆固醇的浓度。所有这些参数均可实验测量，LDL胆固醇例外，其使用Friedewald公式进行估算。该公式的一个关键限制是其在某些条件下不精确。而且，由于脂蛋白颗粒的尺寸和颗粒数也可与脂质相关性疾病的正确诊断有关，因此测量HDL和LDL脂蛋白级分中胆固醇的量不能满足在每种情况下预测心血管风险。因此，脂蛋白颗粒在心血管疾病和代谢紊乱中起主要作用。脂蛋白根据其尺寸和密度分为五个主要级分：乳糜微粒(Q；半径)、极低密度脂蛋白(verylowdensitylipoprotein，VLDL；半径)、中密度脂蛋白(intermediatedensitylipoprotein，IDL；半径)、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，LDL；半径)和高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，HDL；半径)。这些主要级分可进一步分为不同的亚类(subclass)以获得更为详细的脂蛋白谱。公认的是，脂蛋白颗粒的结构基本上为球形并且包括内核心和外壳，其中非极性脂质(三酰甘油和胆固醇酯)见于核心中，而极性脂质(磷脂和游离胆固醇)分布于整个表面单层(壳)。脂蛋白的蛋白质组分(称为载脂蛋白或脱辅基蛋白)与极性脂质一起位于壳上。高级脂蛋白测试(advancedlipoproteintesting，ALT)旨在提供有关脂蛋白颗粒的最详细信息。在目前使用的高级脂蛋白测试的分析技术中，可提及以下：■密度梯度超速离心(DensityGradientUltracentrifugation)，其允许测量不同脂蛋白亚类的相对胆固醇分布(K.R.Kulkarni等，QuantificationofcholesterolinalllipoproteinclassesbytheVAP-IImethod，JournalofLipidResearch35(1994)159-168)。然而，其不提供甘油三酯的浓度，或者脂蛋白颗粒的数目和尺寸。■梯度凝胶电泳(GradientGelElectrophoresis)，其可根据LDL和HDL亚类的尺寸直接从血浆对LDL和HDL亚类进行分级(G.R.Warnick等，Polyacrylamidegradientgelelectrophoresisoflipoproteinsubclasses，ClinicsinLaboratoryMedicine26(2006)803)。该方法需要定制的凝胶并且需要严格注意实验室质量控制，因为凝胶质量和实验室条件的小变化可影响准确度。■高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography)测量主要脂蛋白及其亚类的尺寸以及胆固醇和甘油三酯含量(M.Okazaki等，ComponentanalysisofHPLCprofilesofuniquelipoproteinsubclasscholesterolsfordetectionofcoronaryarterydisease，ClinicalChemistry52(2006)2049-2053)。■离子迁移率分析(IonMobilityAnalysis)依赖于气相化脂蛋白颗粒的电泳迁移率的差异并且允许测量一些脂蛋白亚类的尺寸和浓度(M.P.Caulfield等，Directdeterminationoflipoproteinparticlesizesandconcentrationsbyionmobilityanalysis，ClinicalChemistry54(2008)1307-1316)。■1H-NMR光谱学，其基于复杂的线形拟合技术来量化脂蛋白亚类(M.Ala-Korpela等，1HNMR-basedabsolutequantificationofhumanlipoproteinsandtheirlipidcontentsdirectlyfromplasma，JournalofLipidResearch(1994)2292-2304)。然而，所述技术需要使用之前表征的谱文库，并且具有在分析血浆谱中发生广泛脂蛋白信号重叠的缺点。■脂蛋白级分的扩散-排序NMR光谱学(Diffusion-OrderedNMRSpectroscopy)，其使用分离的脂蛋白的甲基峰来计算脂蛋白的扩散系数并且由该数值估算其尺寸(R.Mallol等，ParticlesizemeasurementoflipoproteinfractionsusingdiffusionorderedNMRspectroscopy，AnalyticalandBioanalyticalChemistry402(2012)2407-2415)。然而，该方法需要对样品进行超速离心以获得不同脂蛋白级分的前步骤，并且不能在血清或血浆样品中直接使用。物理分离不同脂蛋白级分和亚类的分析方法(例如超速离心)费力且耗时。此外，样品经受高度操作，并且其可能在4℃下持续数天。此外，ALT方法尚未准备好用于常规临床用途，其一些限制为缺乏标准化和可变操作。因此，需要这样的方法，其允许使用单一分析并且无需处理或破坏样品来由血清或血浆样品直接可靠地表征不同的脂蛋白级分和亚类。这将可用于开发和监测饮食和药物治疗，并且了解心血管疾病的病理生理学。
技术实现思路
本专利技术通过提供根据权利要求1所述的方法克服了上述问题。从属权利要求对本专利技术的一些优选实施方案进行了限定。目前，LDL和HDL胆固醇是常规用于评估个体的心血管风险的两个心血管风险因素。然而，高百分比遭受心血管事件的个体具有正常的LDL胆固醇水平。患有代谢紊乱(例如糖尿病)的患者往往具有更小、胆固醇含量更差并且更加致动脉粥样化的LDL脂蛋白。这一较小尺寸与较多的颗粒数有关，由此导致胆固醇浓度类似于以下模式的胆固醇浓度：较低浓度的较大较不致动脉粥样化颗粒。这是为什么关注确定LDL脂蛋白颗粒的尺寸和数目而非其脂质载量来评估患者的心血管风险的原因。此外，有研究指出，与HDL胆固醇相比，HDL颗粒的尺寸和数目是更好的心血管风险预示。本专利技术允许彻底地表征脂蛋白颗粒，在样品中以快速且可靠的方式提供主要脂蛋白级分和亚类的颗粒尺寸和数目而无需对不同的脂蛋白级分和亚类进行物理分离。根据本专利技术的方法包括以下步骤：-获得样品的2D扩散-排序1HNMR谱；-使用多个模型函数来进行对应于甲基信号的谱部分的曲面拟合(surfacefitting)，每个模型函数对应于与脂蛋白级分和亚类相关联的给定颗粒尺寸并且包括至少一个在所述拟合期间待估算的模型参数，估算的模型参数为模型参数组，为此使NMR信号和作为所述模型函数之线性组合而建立的模型信号之间的差异最小化，其中每个模型函数为具有以下形式的洛伦兹函数(lorentzianfunction)的三元组(triplet)：三元组j＝洛伦兹(h1j，fj-f0j，wj本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于表征样品中的脂蛋白的体外方法，其包括以下步骤：‑获得所述样品的2D扩散‑排序1H NMR谱；‑使用多个模型函数进行对应于甲基信号的谱部分的曲面拟合，每个模型函数对应于与脂蛋白级分和亚类相关联的给定颗粒尺寸并且包括至少一个在所述拟合期间待估算的模型参数，所述估算的模型参数为模型参数组，为此使NMR信号和作为所述模型函数之线性组合而建立的模型信号之间的差异最小化，其中每个模型函数为具有以下形式的洛伦兹函数的三元组：三元组＝洛伦兹(h1，f‑f0，w，D)+洛伦兹(h2，f，w，D)+洛伦兹(h3，f+f0，w，D)，其中h(au)、f(ppm)、w(ppm)和D(cm2s‑1)分别为与脂蛋白颗粒尺寸相关联的强度、化学位移、宽度和扩散系数，并且其中针对每个脂蛋白颗粒尺寸待确定的所述模型参数为来自f、f0、h1、h2、h3、w和D中的一个或数个。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.27 EP 13382478.91.用于表征样品中的脂蛋白的体外方法，其包括以下步骤：-获得所述样品的2D扩散-排序1HNMR谱；-使用多个模型函数进行对应于甲基信号的谱部分的曲面拟合，每个模型函数对应于与脂蛋白级分和亚类相关联的给定颗粒尺寸并且包括至少一个在所述拟合期间待估算的模型参数，所述估算的模型参数为模型参数组，为此使NMR信号和作为所述模型函数之线性组合而建立的模型信号之间的差异最小化，其中每个模型函数为具有以下形式的洛伦兹函数的三元组：三元组＝洛伦兹(h1，f-f0，w，D)+洛伦兹(h2，f，w，D)+洛伦兹(h3，f+f0，w，D)，其中h(au)、f(ppm)、w(ppm)和D(cm2s-1)分别为与脂蛋白颗粒尺寸相关联的强度、化学位移、宽度和扩散系数，并且其中针对每个脂蛋白颗粒尺寸待确定的所述模型参数为来自f、f0、h1、h2、h3、w和D中的一个或数个。2.根据权利要求1所述的体外方法，其包括鉴定所述样品中存在的所述脂蛋白为与对由所述拟合产生的理论模型信号具有贡献的所述模型函数相关联的那些。3.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其中对于每个模型函数：h1＝α·h2，其中并且h3＝β·h2，其中4.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其中所述洛伦兹函数的三元组具有以下形式：三元组＝洛伦兹(h1，f-f0，w，D)+洛伦兹(h2，f，w，D)+洛伦兹(h1，f+f0，w，D)。5.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其中如/或f0＝0.01ppm。6.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其中基于NMR、HPLC、梯度凝胶电泳或原子力显微镜实验定义所述脂蛋白颗粒尺寸。7.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其中所述曲面拟合如下进行：固定至少一个模型参数并且使用至少一个其他模型参数作为在所述曲面拟合中待确定的自由参数。8.根据权利要求7所述的体外方法，其中固定化学位移、宽度和扩散系数中的至少一个并且至少使用中心洛伦兹的信号强度(h2)作为自由参数。9.根据权利要求7或8中任一项所述的体外方法，其中基于所述脂蛋白颗粒尺寸并且基于回归模型确定所述固定的模型参数，每个回归模型使模型参数和所述脂蛋白颗粒尺寸联系起来。10.根据权利要求9所述的体外方法，其中所使用的所述回归模型由使用具有以强度、化学位移、宽度和扩散系数为自由模型参数的多个模型洛伦兹函数对多个NMR谱的甲基信号进行去卷积获得，所述自由模型参数经估算以使NMR甲基信号和作为所述模型函数之线性组合而建立的所述模型信号之间的差异最小化，所述回归模型分别至少使(i)所述化学位移和所述脂蛋白颗粒尺寸联系起来，和/或使(ii)所述宽度和所述脂蛋白颗粒尺寸联系起来。11.根据权利要求9所述的体外方法，其中使模型参数对联系起来的所述回归模型根...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗格·马洛尔帕雷拉，努里亚·阿米戈格罗，沙维尔·科雷格布朗沙尔，路易·马沙娜马林，米格尔·安格尔·罗德里格斯马丁内斯，梅塞德斯·海拉斯伊瓦涅斯，努里亚·普拉纳吉尔，若塞普·里瓦尔塔维韦斯，
申请(专利权)人：威尔吉利健康研究所，罗维拉威尔吉利大学，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES