本发明专利技术属于肿瘤药物领域，公开了千层纸素在制备靶向作用肝癌细胞甲胎蛋白的抑制剂中的应用。本发明专利技术的技术方案为千层纸素在制备靶向作用于肝癌细胞甲胎蛋白的抑制剂中的应用。本发明专利技术证明了千层纸素能够靶向作用于肝癌的临床诊断标志AFP，下调其蛋白水平，并直接与AFP结合，抑制AFP与抑癌蛋白PTEN的结合，具有抑制肝癌细胞的增殖并诱导肝癌细胞凋亡的效果，具有较好的临床价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤药物领域，涉及千层纸素在制备靶向作用肝癌细胞甲胎蛋白的抑制剂中的应用。
技术介绍
千层纸素(OroxylinA)是黄芩的活性组分之一，具有明显的抗肿瘤作用，是一个具有广阔应用前景的天然抗肿瘤药物。然而，千层纸素药理作用广泛，其抗肿瘤作用的机制目前尚未完全阐明，文献表明千层纸素可以通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥其抗肿瘤作用，也具有抑制肿瘤血管生长的作用。同时，千层纸素的抗癌作用与一般的化疗抗癌药有所区别，能选择性的杀伤肿瘤细胞，而对正常的造血系统影响较小，这是目前肿瘤化疗药物所不具备的。甲胎蛋白(α-fetoprotein，αFP或AFP)主要在胎儿肝中合成，在胎儿13周AFP占血浆蛋白总量的1/3。在妊娠30周达最高峰，以后逐渐下降，出生时血浆中浓度为高峰期的1％左右，约40mg/L，在周岁时接近成人水平(低于30μg/L)。当肝细胞发生癌变时，又恢复了产生这种蛋白质的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。AFP可以在大约80％的肝癌患者血清中升高。研究表明AFP具有抑制原发性肝癌患者和肝癌小鼠的免疫系统功能，能够促进肝癌细胞生长，能够通过调节TNER(肿瘤坏死因子受体)的表达导致肝癌逃避机体的免疫监视。目前尚没有千层纸素对肝癌细胞的甲胎蛋白影响的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供千层纸素在制备靶向作用于肝癌细胞甲胎蛋白的抑制剂中的应用。本专利技术通过实验证明了千层纸素能够靶向作用于肝癌的临床诊断标志AFP，下调其蛋白水平，并直接与AFP结合，抑制AFP与抑癌蛋白PTEN的结合，具有抑制肝癌细胞的增殖并诱导肝癌细胞凋亡的效果，故而提出千层纸素在制备靶向作用于肝癌细胞甲胎蛋白的抑制剂中的应用的技术方案。100μM千层纸素作用48小时后，能明显降低AFP的蛋白水平，并抑制AFP与PTEN的结合；50μM千层纸素作用72小时后亦能发挥明显的抑制作用。本专利技术有益效果：本专利技术证明了千层纸素能够靶向作用于肝癌的临床诊断标志AFP，下调其蛋白水平，并直接与AFP结合，抑制AFP与抑癌蛋白PTEN的结合，可能是其抑制肝癌细胞的增殖并诱导肝癌细胞凋亡的重要机制。因此，千层纸素可以作为靶向作用于肝癌细胞甲胎蛋白的抑制剂，可以选择性杀伤肝癌细胞，具有较好的临床价值。附图说明图1.千层纸素对人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用。图2.千层纸素对人肝癌细胞HepG2的凋亡作用。图3.千层纸素对肝癌细胞株AFP蛋白水平的影响。图4.千层纸素结合AFP蛋白的SRP感应图。图5.千层纸素与AFP蛋白的亲和力常数分析。图6.千层纸素对肝癌细胞株AFP与PTEN结合的调节作用。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述。实施例1本研究针对黄酮类肿瘤化合物千层纸素的抗肝癌靶点及作用机制，展开了深入研究。通过细胞生物学、生物化学等研究手段，发现千层纸素能够靶向肝癌的临床诊断标志AFP，下调其基因及蛋白水平，并直接与AFP结合，抑制AFP与抑癌蛋白PTEN的结合，进而抑制肝癌细胞的增殖并诱导肝癌细胞凋亡。1、实验材料(1)药物千层纸素(C16H12O5，相对分子量为284.263)购自中国药科大学药学院(专利号ZL200910029867.9)，纯度为99％以上，DMSO配制成200mM的母液，-20℃保存。临用前用含血清的培养液稀释成所需浓度。(2)细胞人肝癌HepG2细胞购自于上海细胞生物学研究所细胞库。用含有100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素、10％热失活胎牛血清和碳酸氢钠(NaHCO3，2.2％，w/v)的DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)培养基培养，细胞置于5％CO2、37℃培养箱孵育。(3)细胞培养试剂DMEM培养基：购自美国GIBCO公司。取DMEM粉末13.5g溶于1000mL三蒸水中，加入3.7gNaHCO3，最后均用1MHCl将pH值调至7.2-7.4。圆通式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。胎牛血清：美国GIBCO公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于4℃低温冰箱中。PBS缓冲液：称取NaCl8.0g、KCl0.20g、Na2HPO4·H2O1.56g、KH2PO42.0g，溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。0.02％EDTA溶液：称取EDTA20mg，溶于100mL的PBS缓冲液中，高压灭菌，4℃冰箱保存。(4)MTT溶液MTT粉末购自美国Fluka公司产品。称取250mgMTT加到50mL0.01MPBS(pH7.2)溶液中，均匀混合，配成5mg/mL的MTT溶液，微孔滤膜过滤除菌，4℃避光保存。(5)AnnexinV/PI双染凋亡检测试剂盒：南京凯基生物科技发展有限公司。(6)免疫印迹常用试剂①BCA(Bicinchoninicacid)蛋白测定试剂盒：美国Thermo公司。②细胞裂解液配方：50mMTris-HCl(pH7.5)；150mMNaCl；0.5～1％NP-40；0.1％SDS；1mMEDTA(使用前加入0.2mMPMSF、0.1mMNaF、0.1mMNa3VO4和1mMDTT)③4×SDS凝胶加样缓冲液：100mMTris-Cl(pH6.8)；4％(w/v)SDS；0.2％(w/v)溴酚蓝；20％(v/v)甘油；200mMβ-巯基乙醇(BME)；dH2O④5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mMTris；250mMGly(pH8.3)；0.1％SDS；dH2O⑤10％分离胶：30％聚丙稀酰胺溶液(29％丙烯酰胺；1％甲叉丙烯酰胺)；1.5MTris(pH8.8)；10％SDS；dH2O；临用前加入10％过硫酸铵、TEMED5％浓缩胶：30％聚丙稀酰胺溶液(29％丙烯酰胺；1％甲叉丙烯酰胺)；1.0MTris(pH6.8)；10％SDS；dH2O；临用前加入10％过硫酸铵、TEMED⑥蛋白质预染Marker：美国PIRECE公司产品。⑦转移缓冲液(/L)：39mMGly；48mMTris；0.037％SDS(电泳级)；20％methanol；dH2O⑧丽春红S染液：2％丽春红S；30％三氯乙酸；30％磺基水杨酸；dH2O⑨1％牛血清白蛋白(BSA)封闭液：1％BSA；0.01MPBS⑩PBST(/L)：1‰Tween-20；0.01MPBS(7)抗体抗体AFP(一抗)购自美国cellsignaling公司，临用前均用PBST按1:1000稀释成工作液使用。抗体β-Actin(内参一抗)购自boster公司(Wuhan，China)，临用前用PBST按1:2000稀释成工作液使用。IRDyeTM800Conjugatedanti-mouse/rabbitsecondantibody(二抗)为美国KPL公司产品，临用前按1:10000稀释成工作液使用。(8)人AFP重组蛋白：购自OriGeneTechnologies公司(9)免疫沉淀用ProteinA/GPLUS-Agarose购自SantaCruzBiotechnologys公司。2、本文档来自技高网...
【技术保护点】
千层纸素在制备靶向肝癌细胞甲胎蛋白的抑制剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.千层纸素在制备靶向肝癌细...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭青龙，魏立彬，周煜新，卢娜，赵丽，杨林，傅蓉，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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