本发明专利技术公开一种利拉鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：以2‑Cl Resi n为起始树脂载体，通过固相合成法，并采用特异性微波技术反应，依次连接利拉鲁肽序列中相对应的氨基酸，得到Fmoc‑利拉鲁肽Ⅰ‑2‑Cl‑Resin；脱除赖氨酸的侧链保护基Dde，通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，并在谷氨酸上连接棕榈酸，得到利拉鲁肽Ⅱ‑2‑Cl‑Resin；切割沉降、冻干后，得到利拉鲁肽粗肽产品；本发明专利技术采用Fmoc固相合成法，以2‑Cl Resin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂，采用特异性微波合成技术，提高了缩合效率。本发明专利技术大大缩短了反应时间，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于多肽药物合成的
，特别涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法。
技术介绍
利拉鲁肽，多肽序列为HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(E-pal)EFIAWLVRGRG，分子式为C172H265N43O51，分子量为3751.20Da。利拉鲁肽是通过基因重组技术，利用酵母生产的人胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物，具有降低血糖、减轻体重、促进胰岛细胞再生以及心血管系统保护等多种效应，临床应用前景广阔。现有的利拉鲁肽合成方法多为固液合成法，且合成周期长，生产成本高，不利于利拉鲁肽的大规模生产。US6268343B1和US6458924B2的合成方法中，中间体GLP-1(7-37)-OH均是在液相条件下与Nα-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应，由此会导致产生许多杂质，降低产品的纯度和使用效果。授权公告号CN103145828B一种利拉鲁肽的全固相合成方法，以2-Cl-TrtResin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂，经过微波反应技术的处理，缩短了反应时间，提高了缩合效率。侧链修饰采用新颖ivDde侧链保护的赖氨酸，进行侧链修饰合成，期间采用20％哌啶脱Fmoc保护，直至直链多肽合成完毕。其次采用水合肼脱ivDde保护后，进行侧链修饰反应，得到的在固相载体上的全保护利拉鲁肽通过三氟醋酸的处理得到利拉鲁肽粗品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利拉鲁肽的固相合成方法，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产利拉鲁肽粗肽产品的广泛应用前景,以用于大规模生产利拉鲁肽。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种利拉鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：(1)以2-ClResin为起始树脂载体，通过固相合成法，并采用特异性微波技术反应，依次连接利拉鲁肽序列中相对应的氨基酸，得到Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin如下：Fmoc-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(Dde)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin；(2)脱除赖氨酸的侧链保护基Dde，通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH，并在谷氨酸上连接棕榈酸，得到利拉鲁肽Ⅱ-2-Cl-Resin如下：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(E-pal)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin；(3)切割沉降、冻干后，得到利拉鲁肽粗肽产品如下：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(E-pal)EFIAWLVRGRG；步骤(1)所述氯树脂优选为2-ClResin；反应中以DIC/HOBt为缩合剂和活化试剂，以20％Pip/DMF溶液为脱保护试剂，进行多肽的连续缩合反应；所述特异性微波反应技术指在氨基酸的缩合反应步骤，缩合反应15min后，将Fmoc-利拉鲁肽-2-ClResin使用特异性的微波合成反应20s。步骤(1)中缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，缩合反应中氨基酸投料量为1.5倍所投树脂摩尔数，缩合反应温度为25℃。步骤(2)所述脱除赖氨酸的侧链保护基Dde的脱除反应，脱除试剂为水合肼：DMF＝1:15体积比的混合溶液，反应液体积为反应器容积的1/3-1/2。步骤(3)所述切割沉降反应，切割试剂为TFA：茴香硫醚：水：EDT：苯酚＝35：2：2：1：2摩尔比，切割液体积为反应器容积的1/2，树脂切割两次，将切割液分别吹入到冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次得到利拉鲁肽粗肽产品。本专利技术的有益效果：本专利技术采用Fmoc固相合成法，以2-ClResin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂，采用特异性微波合成技术，提高了缩合效率。本专利技术大大缩短了反应时间，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。具体实施方式通过下述实施例将有助于理解本专利技术，但不能限制本专利技术的内容。对于本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干简单替换或推演，都视为属于本专利技术的保护范围。实施例一利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成1、2-ClResin的溶胀称量取代度为0.64mmol/g的2-ClResin1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀0.5h。2、Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin为：Fmoc-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(Dde)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-31个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表所示：本专利技术中一些常用的缩写具有以下含义：Fmoc：芴甲氧羰基DMF：N,N-二甲基甲酰胺DCM：二氯甲烷Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰Pip：六氢吡啶TFA：三氟醋酸tBu：叔丁基DIC：N,N-二异丙基碳化二亚胺DIEA：N,N-二异丙基乙胺HOBt：1-羟基苯并三唑(1)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的合成称取118.92mgFmoc-Gly-OH和122mgHOBT放于10ml离心管中，加3mlDCM将其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应1h。(2)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的封头反应配制甲醇：DIEA＝1:1(体积比)的混合液2ml，将其加入到抽干的反应器中，置于20-30r/min的摇床上摇20min。(3)树脂的洗涤方法用真空泵将反应器中的脱保护溶液抽干，然后加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，抽干反应器中溶液再加入DMF洗涤，重复操作3次。(4)脱除Fmoc保护基加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。(5)保护氨基酸的活化方法以Fmoc-Arg(pbf)-Gly-2-Cl-Resin的缩合为例，称取583.9mgFmoc-Arg(pbf)-OH和122mgHOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。(6)Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于25℃的恒温震荡器中反应20-30min，然后将反应器置于微波化学反应器中微波反应20s后洗涤。采用上述同样方法，依次缩合第2-31个Fmoc-保护氨基酸，即得到Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：该固相合成方法包括以下步骤：(1)以2‑Cl Resin为起始树脂载体，经活化剂和缩合剂的缩合反应，并采用特异性微波技术反应，以Fmoc‑保护氨基酸为缩合原料，依次缩合利拉鲁肽氨基酸序列中相对应的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc‑Lys(Dde)‑OH，得到Fmoc‑利拉鲁肽Ⅰ‑2‑Cl‑Resin；(2)脱除赖氨酸侧链保护基Dde，通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，并在谷氨酸上连接棕榈酸，得到利拉鲁肽Ⅱ‑2‑Cl‑Resin；(3)切割沉降、冻干后，得到利拉鲁肽粗肽产品。
【技术特征摘要】
1.一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：该固相合成方法包括以下步骤：(1)以2-ClResin为起始树脂载体，经活化剂和缩合剂的缩合反应，并采用特异性微波技术反应，以Fmoc-保护氨基酸为缩合原料，依次缩合利拉鲁肽氨基酸序列中相对应的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys(Dde)-OH，得到Fmoc-利拉鲁肽Ⅰ-2-Cl-Resin；(2)脱除赖氨酸侧链保护基Dde，通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH，并在谷氨酸上连接棕榈酸，得到利拉鲁肽Ⅱ-2-Cl-Resin；(3)切割沉降、冻干后，得到利拉鲁肽粗肽产品。2.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述的起始氨基树脂为2-ClResin，取代度为0.64mmol/g。3.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中缩合反应过程中以DIC/HOBt为活化剂和缩合剂，缩合反应时间为25min。4.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中在氨基酸的缩合反应步骤，缩合反应15min后，将Fmoc-利拉鲁肽-2-ClResin使用特异性的微波合成反应20s。5.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈为光，武兴伟，
申请(专利权)人：合肥国肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。