检测FⅤ基因第10号外显子的方法和引物技术

本发明专利技术公开了检测FⅤ基因第10号外显子的方法和引物，所述引物、试剂盒均包括扩增覆盖FⅤ基因第10号外显子序列的正、反向引物和测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述测序引物可用于快速检测血栓患者的FⅤ基因第10号外显子序列的突变情况，其中包含了位于10号外显子上的突变位点R506Q。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测FⅤ基因第10号外显子的引物和方法。
技术介绍
易栓症是由于抗凝蛋白、凝血因子、纤溶蛋白等遗传性或获得性缺陷或存在获得性危险因素而容易发生血栓栓塞的状态，主要临床表现类型为静脉血栓栓塞症(venousthromboembolism，VTE)。易栓症可分为遗传性易栓症与获得性易栓症，遗传性危险因素目前主要有：凝血因子V(factorV，FV)Leiden变异、蛋白C(PC)缺乏、蛋白S(PS)缺乏，凝血酶原G20210A(FIIG20210A)基因变异、抗凝血酶(AT)缺乏，高同型半胱氨酸血症等。近年来研究表明FII基因在易栓症中起到了重要的作用。凝血因子Ⅴ(factorⅤ，FⅤ)是凝血过程中一个重要的辅因子，是体内凝血酶原的最主要的激活物，是体内最不稳定的凝血因子。FⅤ位于第1号染色体，基因长74578bp，有25个外显子编码，其mRNA为9179bp，合成2224个氨基酸的肽链。蛋白FⅤ是一个相对分子质量为330×103的单链糖蛋白，由A1-A2-B-A3-C1-C2共6个结构域组成。在凝血过程中，FⅤ在凝血酶的作用下，切去B结构，成为A1-A2结构域组成的重链和A3-C1-C2结构域组成的轻链所构成的活化形式，即FⅤa与FXa、Ca2+于磷脂表面形成凝血酶原激活物，从而激活凝血酶原使之成为具有活性的凝血酶。1994年，Bertina等报道FⅤ基因第10号外显子上的第1691位核苷酸G→A(1691G→A)的基因突变，64例有APCR现象的血栓形成患者中，56例携带有FⅤLeiden突变的等位基因。活化蛋白C抵抗(activatedproteinCresistance，APCR)是深静脉血栓的重要危险因素。而抗APC症的本质是FⅤ基因第10外显子核苷酸1691处发生了G→A的突变，形成一种基因突变的FⅤLeiden，活化的FⅤ不能被APC灭活，使血液凝固加快而引起血栓。提出了FⅤ基因在血栓形成中的作用。多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等均被应用于FⅤ基因突变的检测,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于FⅤ基因容量大、突变类型多、突变率高、突变位点散在分布,故而阻止了对FⅤ基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。本专利技术采用Sanger测序法检测FⅤ基因第10号外显子的突变，并且设计的引物可以扩展整个10号外显子，通过测序结果的分析，可以很直观的了解FⅤ基因第10号外显子的基因突变情况，并不受FⅤ基因的基因突变多样化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。
技术实现思路
本专利技术提供检测FⅤ基因第10号外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测静脉血栓患者体内FⅤ基因第10号外显子突变的情况。扩增覆盖检测FⅤ基因第10号外显子突变的正向引物(1691-F)和反向引物(1691-R)的碱基序列为：1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA3'1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA3'进一步地，所述引物还包括正向测序引物(1691-F)和反向测序引物(1691-R)，其碱基序列为：1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA3'1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA3'进一步地，所述扩增的正反向引物的使用浓度比为：1691-F：1691-R＝1:1。进一步地，所述测序的正反向引物的使用浓度比为：1691-F：1691-R＝1:1。本专利技术的目的还在于提供一种检测FⅤ基因第10号外显子的方法，其包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)利用扩增引物1691-F与1691-R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测FⅤ基因第10号外显子突变的扩增产物；(3)利用测序引物1691-F与1691-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与野生型FⅤ基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA3'1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA3'本专利技术的目的还在于提供一种检测FⅤ基因第10号外显子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括扩增引物1691-F与1691-R，测序体系包括测序引物1691-F与1691-R，包括：1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA3'1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA3'进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCRBuffer；dNTPs；KODFXDNAPolymerase。进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和BigdyeTerminatorV3.1。进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。本专利技术设计了扩增覆盖检测FⅤ基因第10号外显子的正、反向引物，以及对所获得的扩增产物进行正反向测序的测序引物。对送检样本进行PCR扩增，采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测FⅤ基因第10号外显子的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。有益效果：利用本专利技术所述扩展引物和测序引物，可以扩展第10号外显子，通过测序结果的分析，可以很直观的了解FⅤ基因第10号外显子的基因突变情况，并不受FⅤ基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。附图说明图1为FⅤ基因在染色体上定位图。图2为1691-F/R的电泳图，M为MarkerDL2000，1-24为送检的患者血液样本1-24号，如图2所示，引物1691-F/R扩增有效，且条带单一。图3样本3第10号外显子序列的正向测序结果。图4样本6第10号外显子序列的正向测序结果。图5样本3第10号外显子序列的反向测序结果。图6样本6第10号外显子序列的反向测序结果。方框部分为FⅤ基因第10号外显子序列G1691A的位置，图中测序结果显示这些样品均未发生突变。具体实施方式下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本专利技术。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例1检测FⅤ基因第10号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测FⅤ基因第10号外显子序列的正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测FⅤ基因第10号外显子的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测FⅤ基因第10号外显子的正向引物和反向引物，其碱基序列为：1691‑F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA 3'1691‑R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA 3'

【技术特征摘要】
1.检测FⅤ基因第10号外显子的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测FⅤ基因第10号外显子的正向引物和反向引物，其碱基序列为：1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA3'1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA3'2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括正向测序引物和反向测序引物，其碱基序列为：1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA3'1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA3'3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正向引物和反向引物的使用浓度比为：1691-F：1691-R＝1：1。4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正向测序引物和反向测序引物的使用浓度比为：1691-F：169...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘赵玲，单战，王淑一，
申请(专利权)人：南京艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32