α‑淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有α‑淀粉酶活性的变体和编码这些变体的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，包含这些变体的组合物，以及产生和使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对序列表的引用本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及α-淀粉酶变体(具有α-淀粉酶活性的多肽)、编码α-淀粉酶的核酸、生产α-淀粉酶的方法、包括α-淀粉酶的组合物以及使用α-淀粉酶的方法。相关领域描述α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。α-淀粉酶在工业上用于若干种已知应用的用途具有悠久历史，这些用途如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，例如在制备高果糖糖浆中或用作从淀粉生产乙醇的一部分。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。属于首先被使用的细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，还称作特妙淀粉酶(Termamyl)，所述特妙淀粉酶已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。芽孢杆菌淀粉酶如特妙淀粉酶、AA560(WO2000/060060)和SP707(通过冢本(Tsukamoto)等人，1988，生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)151:25-31)形成一个特定的已经用于洗涤剂中的α-淀粉酶的组。这些淀粉酶已经经修饰以改进洗涤剂中的稳定性。WO96/23873例如披露了缺失SP707(WO96/23873的SEQIDNO:7)的氨基酸181+182或氨基酸183+184以改进此淀粉酶的稳定性。WO96/23873另外披露了通过用例如亮氨酸取代M202来修饰SP707淀粉酶以使该分子对氧化保持稳定。因而，修饰淀粉酶来改进某些特性是已知的。最近，出于环境原因，在洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中降低温度已经变得日益重要。尽管当前洗涤剂酶组合物的功效，但尤其由于低(例如冷水)洗涤温度和更短洗涤循环，有许多难以完全去除的污渍。因而，对可以在低温下起作用并同时保留或增加令人希望的α-淀粉酶特性如比活性(淀粉分解活性)、稳定性、污渍去除效果和/或洗涤性能的淀粉分解酶存在需要。本专利技术的诸位专利技术人先前已经发现，SEQIDNO:2的淀粉酶变体在洗涤剂中具有非常好的稳定性(在欧洲专利申请号13194116.3中披露为具有(H183+G184)缺失和(N195F+I206Y)取代的SEQIDNO:1)。本专利技术的目的是提高该变体的洗涤性能。因而，本专利技术的目的是提供具有α-淀粉酶活性(α-淀粉酶)的多肽，这些多肽在衣物洗涤和/或餐具洗涤中具有高性能、尤其在低温具有高洗涤性能。本专利技术的又一目的是提供在洗涤剂组合物中、特别地在液体衣物和/或餐具洗涤洗涤剂组合物中具有高稳定性的α-淀粉酶。又一目的是提供在粉末状洗涤剂组合物中具有高稳定性的α-淀粉酶和/或在洗涤剂中存储后具有高淀粉酶活性的α-淀粉酶。特别地，本专利技术的目的是提供在洗涤剂组合物中具有高稳定性并且在低温(如15℃)具有高洗涤性能两者的α-淀粉酶，其改进的洗涤性能是根据“使用自动机械应力测定的α-淀粉酶的洗涤性能”部分中使用标准洗涤剂A或J确定的。具体而言，本专利技术的目的是提供以下α-淀粉酶，这些α-淀粉酶与SEQIDNO:2的亲本α-淀粉酶相比，或可替代地与其他密切相关的α-淀粉酶如例如SP707α-淀粉酶(SEQIDNO:4)相比，在15℃下具有改进的洗涤性能。专利技术既述本专利技术涉及α-淀粉酶变体，该变体包括a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或三个或四个位置处的缺失和/或取代，以及b)在一个或多个位置处的取代，所述取代对应于位置1、2、3、4、5、7、9、16、25、26、28、36、40、47、48、50、51、56、67、72、73、75、85、86、87、98、109、112、113、118、119、125、128、133、134、136、140、141、142、144、146、149、155、158、160、165、167、169、171、172、173、174、179、181、182、184、186、192、193、194、195、197、200、202、204、206、208、210、211、112、213、214、215、217、218、219、220、226、241、243、246、255、265、268、269、270、273、274、276、280、282、283、291、294、295、296、299、302、303、304、305、311、315、319、320、321、323、324、330、336、343、345、346、349、351、354、355、361、363、364、376、380、383、391、402、405、406、408、410、411、414、415、416、418、421、423、424、427、429、430、431、438、439、442、444、446、447、449、457、463、464、465、466、467、469、471、473、474、476、477、478、482、或483，和/或在对应于SEQIDNO:1的1、2、3、4、5、172、173或174的一个或多个位置处的缺失，并且该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。本专利技术进一步涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；包含这些变体的组合物；以及生产这些变体的方法。本专利技术进一步涉及包含所述变体的组合物如洗涤剂组合物，并且涉及这些变体的用途。定义A-、B-和C-结构域：α-淀粉酶的结构包括三个不同结构域A、B和C，参见例如马姬丝(Machius)等人，1995，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)246:545-559。术语“结构域”意指本身形成完整分子的不同且独立的子结构的多肽区域。α-淀粉酶由携带活性位点残基的β/α-8桶状结构(其记为A-结构域)、β-片层3和α-螺旋3之间相当长的环状结构(其记为B-结构域)(一起；“A和B结构域”)和C-结构域组成，并且在某些情况下还包含糖结合结构域(例如，W02005/001064；马奇斯(Machius)等人，见上文)。α-淀粉酶的结构域可以通过结构分析来确定，如使用结晶学技术。用于确定α-淀粉酶的结构域的可替代方法是通过该α-淀粉酶与另一个已经确定结构域的α-淀粉酶的氨基酸序列的序列比对。与例如已经确定了C-结构域的α-淀粉酶中的C-结构域序列对齐的序列可以视为给定α-淀粉酶的C-结构域。A和B结构域：如在此所使用的术语“A和B结构域”意指这些视为一个单元的两个结构域，然而该C结构域是这些α-淀粉酶的另一个单元。因而，“A和B结构域”的氨基酸序列被理解为包括“A和B结构域”和其他结构域(如C结构域)的α-淀粉酶的序列的一个序列或序列的一部分。如在此所使用，α-淀粉酶的“A和B结构域”对应于SEQIDNO:4的氨基酸1-399。α-淀粉酶：术语“α-淀粉酶”与术语“具有α-淀粉酶活性的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑淀粉酶变体，包括a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代，以及b)在一个或多个位置处的取代，所述取代对应于位置1、2、3、4、5、7、9、16、25、26、28、36、40、47、48、50、51、56、67、72、73、75、85、86、87、98、109、112、113、118、119、125、128、133、134、136、140、141、142、144、146、149、155、158、160、165、167、169、171、172、173、174、179、181、182、184、186、192、193、194、195、197、200、202、204、206、208、210、211、112、213、214、215、217、218、219、220、226、241、243、246、255、265、268、269、270、273、274、276、280、282、283、291、294、295、296、299、302、303、304、305、311、315、319、320、321、323、324、330、336、343、345、346、349、351、354、355、361、363、364、376、380、383、391、402、405、406、408、410、411、414、415、416、418、421、423、424、427、429、430、431、438、439、442、444、446、447、449、457、463、464、465、466、467、469、471、473、474、476、477、478、482、或483，和/或在对应于SEQ ID NO:1的1、2、3、4、5、172、173或174的一个或多个位置处的缺失，其中该α‑淀粉酶变体与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α‑淀粉酶活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.14 EP 14180943.4;2014.06.12 IN 2877/CHE/201.一种α-淀粉酶变体，包括a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代，以及b)在一个或多个位置处的取代，所述取代对应于位置1、2、3、4、5、7、9、16、25、26、28、36、40、47、48、50、51、56、67、72、73、75、85、86、87、98、109、112、113、118、119、125、128、133、134、136、140、141、142、144、146、149、155、158、160、165、167、169、171、172、173、174、179、181、182、184、186、192、193、194、195、197、200、202、204、206、208、210、211、112、213、214、215、217、218、219、220、226、241、243、246、255、265、268、269、270、273、274、276、280、282、283、291、294、295、296、299、302、303、304、305、311、315、319、320、321、323、324、330、336、343、345、346、349、351、354、355、361、363、364、376、380、383、391、402、405、406、408、410、411、414、415、416、418、421、423、424、427、429、430、431、438、439、442、444、446、447、449、457、463、464、465、466、467、469、471、473、474、476、477、478、482、或483，和/或在对应于SEQIDNO:1的1、2、3、4、5、172、173或174的一个或多个位置处的缺失，其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。2.根据权利要求1所述的变体，其中a)包括对应于R181+G182、R181+H183、R181+G184、G182+H183、G182+G184或H183+G184的氨基酸的成对缺失。3.根据权利要求1或2中任一项所述的变体，其中b)包括所述取代中的两个或更多个。4.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括所述取代中的三个或更多个。5.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括所述取代中的四个或更多个。6.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括所述取代中的五个或更多个。7.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括所述取代中的六个或更多个。8.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括所述缺失中的一个或更多个。9.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括选自下组的取代或缺失或由它们组成，该组由以下各项组成：H1*、H1L、H1G、H1W、H1R、H1K、H1S、H1L、H1N、H1V、H2*、H2E、H2V、H2A、H2C、H2Q、N3*、N3C、N3D、N3S、N3C、G4*、G4V、G4S、T5*、T5K、G7S、G7L、G7E、G7Q、G7D、G7N、G7K、G7A、G7P、G7H、M9V、Y16D、N25D、R26Q、N28D、N28S、S36D、T40K、T40M、T40I、A47G、A47S、W48L、G50A、G50S、A51T、A51V、A51I、A51L、A51Q、A51P、A51S、A51F、V56A、V56T、G67E、K72S、K72R、K72H、G73V、V75I、V75F、L85F、Q86H、A87S、A87D、Q98V、Q98S、Q98A、Q98N、Q98T、Q98L、Q98K、G109S、D112H、D112N、A113Y、A113H、A113Q、A113S、A113N、A113L、A113T、R118K、R118G、R118P、R118L、R118S、R118D、A119P、N128G、N128V、N128L、N128T、N128H、N128M、N128F、N128Q、G133Q、G133V、E134D、T136N、W140Y、T141S、R142Q、R142K、R142T、R142S、D144Q、D144T、P146S、G149Q、G149R、G149K、G149A、G149L、F155Y、R158G、R158A、Y160H、Y160L、Y160R、Y160Q、Y160G、V165G、V165M、V165A、V165L、V165Q、V165S、W167L、W167F、W167Y、W167H、Q169K、Q169R、Q169G、Q169M、R171E、R171S、R171H、R172*、R172Y、R172L、R172S、R172P、R172T、R172V、R172A、R172M、R172Q、R172K、R172N、R172D、R172E、L173V、L173T、L173F、L173I、N174L、N174Y、N174G、N174Q、N174S、N174E、N174T、N174D、N174H、K179S、K179M、K179P、K179R、K179A、K179T、K179L、R181G、G182N、G182A、G182S、G182N、G182V、G184S、G184N、G184*、A186E、A186V、A186S、A186T、A186M、A186W、A186H、D192E、D192A、D192G、T193V、T193M、T193S、T193G、T193A、T193N、E194S、E194A、N195F、N197A、M200L、M202A、A204T、A204V、A204G、I206Y、M208S、M208G、M208W、M208Y、H210M、H210Y、H210S、H210D、P211E、P211G、P211V、P211D、P211A、P211W、P211T、P211H、P211Q、E212D、V213T、V213S、V214I、V214S、V214T、N215A、N215G、N215D、L217M、L217F、R218K、N219S、N219K、N219E、N219T、N219G、N219R、W220F、N226T、I241F、Y243E、Y243L、Y243I、Y243F、Y243S、Y243G、Y243D、Y243T、Y243P、T246M、S255I、S255N、S255K、A265S、W268F、W268L、K269G、K269S、K269L、K269R、K269N、K269I、K269V、K269M、K269Q、K269H、N270A、N270P、N270G、N270Y、G273V、A274K、A274W、A274T、A274S、A274E、A274C、A274Y、A274L、A274M、A274H、A274R、A274V、A274I、E276S、E276N、Q280R、Q280S、Q280K、Q280H、T282G、N283H、N283L、N283D、N283V、N283A、N283R、N283G、V291A、H294G、Y295N、N296Q、N299K、N299G、N299T、K302A、K302R、K302Q、K302N、S303R、S303G、G304R、G304V、G304A、G304S、G304Q、G305S、G305A、G305N、G305R、G305T、N311S、N311L、N311E、N311D、G315E、Q319K、R320K、R320A、R320S、R320M、R320T、R320V、H321V、H321A、H321L、H321Q、H321N、H321W、H321K、S323K、S323E、S323W、S323M、S323N、S323R、S323Q、H324R、H324W、H324L、H324Q、H324A、H324N、D330A、D330S、D330S、D330A、*336aG、*336bH、*336cG、*336dG、E336G、F343W、E345A、E345S、E345D、E346G、E346A、E346P、E346T、E346K、K349M、K349A、L351A、L351C、L351H、L351Q、L351S、L351K、A354V、L355V、Q361S、Q361A、Y363L、P364S、T376K、P380Q、R383K、E391A、E391T、E391M、E391L、E391K、E391H、E391N、H402N、L405V、D406A、P408H、P408Q、V410R、I411M、T414K、R415K、E416K、D418L、D418N、D418E、D418H、K423N、K423W、K423L、K423H、K423P、K423T、S424Q、A427V、L429A、L429F、I430M、I430L、I430E、T431P、K438N、R439G、A442V、N446K、A447V、A447T、E449K、E449G、K463R、N457T、K463R、I464T、I464S、G465L,S466F、D467G、W469L、E471N、E471K、H473S、V474T、V474I、D476G、D476K、D476Q、D476Y、G477A、G477S、G477Q、G477K、G477T、S478A、Y482F、K483R、H1*+H2E、H1*+H2V、H1*+H2A、H1*+N3C、H1L+A113Y+R171E+D192E、H1*+H2*+G7S、H1L+R171E+D192E、H2C、T5*+G4*+N3*+R320A、G4V+E134D+K179L、G7E+R320M+S323M、G7Q+Q98S+R320S+H324Q、G7E+R320A+H324Q、G7L+Q98N+R320A+S323N、G7E+Q98T+R320A、G7L+R320S+S323M、G7D+Q98A+R320M、G7N+Q98L+R320A+S323M、G7E+Q98A+R320M、G7N+R320S、G7K+R320A+S323M+H324L、G7L+P211Q+S303G+R320A、G7N+R320A+S323M、G7Q+R320S+S323M、G7N+R320A、G7E+R320A+S323M、G7A+Q98L+R320M、G7A+R320M、G7P+R320S+S323K、G7Q+R320A+S323N、G7L+Q98A+R320A+S323M、G7Q+R320M+S323N+H324W、G7S+R320A+S323N+H324Q、G7L+R320A、G7K+R320M+H321Q、G7N+R320A+S323N、G7Q+R320S+H321N+S323M、G7Q+R320A+S323M、G7L+R320S+S323M、G7N+Q98S+R320M+S323N、G7Q+R320A+S323R、G7E+Q98A+K302R+R320A+S323N、G7A+R320S+H321W+S323M、G7K+R320A+P408Q、G7K+R320A+H324L、G7L+R320M+S323N、G7L+R320A+S323M、G7E+R320A+P320Q+S323M、G7K+R320A+S323N+P364S、G7Q+R320A+H321Q+S323M、G7N+R320M、G7H+Q98S+R320A+S323M+H324L、G7Q+R320S+H321N、G7E+R320M、G7Q+Q98T+R320A+S323M、G7K+R320A、G7K+T246M+R320A+S323M、G7N+M9V+Q98A+R320S+S323M、G7Q+Q98A+R320M+S323M、G7Q+Q86H+R320A+S323M、N28D+G109S+A119P+R172D+L173V+N174S、N28S+R320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【专利技术属性】
技术研发人员：C安德森，C加迪亚拉姆，RK萨伊纳坦，P巴卢穆里，PV伊耶，I达马杰，A蒙克，S克里希纳，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK