肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物制造技术

本发明专利技术涉及分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖和它们的制备方法。本发明专利技术还涉及包含共价连接到载体蛋白的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的免疫原性缀合物，它们的制备方法和包含它们的免疫原性组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分离的肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型15B荚膜多糖和它们的制备方法。本专利技术还涉及包含共价连接到载体蛋白的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的免疫原性缀合物，它们的制备方法和包含它们的免疫原性组合物和疫苗。
技术介绍
肺炎链球菌是革兰氏阳性、柳叶刀形球菌，其通常成对出现(双球菌)，也可以短链或作为单细胞出现。它们很容易生长在血琼脂平板上，具有发光的菌落并显示α溶血，除非厌氧培养，它们表现出β溶血。大多数肺炎球菌血清型的细胞具有荚膜，其是每个细胞周围的多糖包衣。此荚膜是在人类中毒力的决定因素，因为其通过阻止抗体附着到细菌细胞而干扰吞噬作用。目前鉴定了超过90种已知的肺炎球菌荚膜血清型，其中23种最常见的血清型占全球侵袭性疾病的大约90％。作为疫苗，肺炎球菌多糖包衣在具有发达的或未受损害的免疫系统的个体中可赋予合理程度的对肺炎链球菌的免疫性，而缀合到合适的载体蛋白的荚膜多糖允许在婴儿和也对于肺炎球菌感染风险最大的老年人中的免疫应答。自从2000年推出第一款7价肺炎球菌缀合疫苗(PCV7或Prevnar)以来，来自那七个血清型(4、6B、9V、14、18C、19F、和23F)的侵袭性疾病已几乎消失。在Prevnar13中加入血清型1、3、5、6A、7F和19A进一步降低了侵袭性肺炎球菌疾病的数目。然而，由非疫苗血清型(诸如肺炎链球菌血清型15A、15B和15C)导致的侵袭性肺炎球菌疾病的发病率最近已增加(参见例如BeallB.等,JournalofClinicalMicrobiology.44(3):999-1017,2006,或Jacobs等,ClinInfectDis.(2008)47(11):1388-1395)。目前市售的肺炎球菌疫苗无一提供在人以及特别是在小于2岁的儿童中针对血清型15B肺炎链球菌的适当的保护。因此，存在对可用于诱导针对血清型15B肺炎链球菌的免疫反应的免疫原性组合物的需要。如果这样的免疫原性组合物可用于保护受试者免受血清型15C和/或15A肺炎链球菌的侵害，也将是额外的益处。专利技术概述在一方面，本公开内容提供了一种具有5kDa-500kDa的分子量的分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖。在进一步的方面，本公开内容提供了分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖，每mM所述肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM，优选至少0.6mM乙酸盐。在进一步的方面，本公开内容提供了分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖，每mM所述肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM，优选至少0.6mM甘油。在进一步的方面，本公开内容提供一种包含共价连接到载体蛋白的本文所公开的分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的免疫原性缀合物。在一方面，所述载体蛋白是CRM197。在进一步的方面，本公开内容提供了包含本文所公开的免疫原性缀合物和生理上可接受的媒介物的免疫原性组合物。在一方面，所述免疫原性组合物还包含至少一种额外的抗原。在一方面，所述免疫原性组合物还包含佐剂。在进一步的方面，本公开内容提供了包含如本文所公开的免疫原性组合物的疫苗。在进一步的方面，本公开内容提供了用于生产如本文所公开的分离的血清型15B多糖的方法，该方法包括以下步骤：(a)制备肺炎链球菌血清型15B细菌细胞的发酵培养物；(b)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；(c)从发酵培养物纯化肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖；和，(d)通过高压均质裁剪(sizing)纯化的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖。在进一步的方面，本公开内容提供一种用于生产活化的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的方法，所述方法包括使如本文所公开的分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖与氧化剂反应的步骤。在一方面，本公开内容提供了通过上述方法获得或可获得的活化的血清型15B荚膜多糖。在进一步的方面，本公开内容提供了包含共价连接到载体蛋白的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的免疫原性缀合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：(a)混合如本文公开的活化的多糖与载体蛋白；(b)使所述混合的活化的多糖和载体蛋白与还原剂反应以形成血清型15B荚膜多糖-载体蛋白缀合物。在一方面，本公开内容提供了通过上述方法获得或可获得的免疫原性结合物。在进一步的方面，本公开内容提供了保护受试者免于血清型15B肺炎链球菌感染的方法，所述方法包括给受试者施用免疫原性量的本文所公开的免疫原性组合物或疫苗。在进一步的方面，本公开内容提供了治疗或预防在受试者中与血清型15A、15B和/或15C肺炎链球菌相关的肺炎链球菌感染、疾病或病况的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的本文中公开的免疫原性组合物或疫苗的步骤。附图简述图1—肺炎球菌荚膜多糖血清型15B重复单元的结构。专利技术详述本专利技术可以通过参考以下本专利技术优选实施方案和本文包括的实施例的详细描述而更容易地理解。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与此专利技术所属领域技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可以用于实践或测试本专利技术，本文仍然描述了某些优选的方法和材料。在描述实施方案和主张本专利技术中，可以根据下列定义使用某些术语。定义如本文所用，多糖或多肽-载体蛋白缀合物的“分子量”指通过尺寸排阻色谱法(SEC)结合多角度激光散射检测器(MALLS)计算得到的分子量。如本文所用，术语“游离多糖”指没有共价缀合到载体蛋白但是却在血清型15B荚膜多糖-载体蛋白缀合物组合物中存在的血清型15B荚膜多糖。游离多糖可以非共价连接(即，非共价结合、吸附、或被捕获于其中或用其捕获)多糖载体蛋白缀合物。游离多糖的百分比在血清型15B荚膜多糖-载体蛋白缀合物的最终纯化后测量。优选地，其在最终纯化后4周内测量。其表示为样品中总的多糖的百分比。如本文所用，术语“血清型15B多糖”或“血清型15B荚膜多糖”指肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖。如本文所用，术语“血清型15B糖缀合物”或“血清型15B缀合物”指共价缀合到载体蛋白的分离的血清型15B多糖。如本文所用，术语“氧化度”(DO)指当分离的多糖用氧化剂活化时每个生成的醛基的糖重复单元数目。多糖的氧化度可以使用本领域技术人员已知的常规方法确定。如本文所用，术语“受试者”指哺乳动物，包括人，或指鸟、鱼、爬行动物、两栖动物或任何其它动物。术语“受试者”还包括家庭宠物或研究动物。家庭宠物和研究动物的非限制性实例包括：狗、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、沙土鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、猴、鸟、蛇、蜥蜴、鱼、龟和蛙。术语“受试者”还包括家畜动物。家畜动物的非限制性实例包括：羊驼、野牛、骆驼、牛、鹿、猪、马、美洲驼、骡、驴、绵羊、山羊、兔、驯鹿、牦牛、鸡、鹅和火鸡。分离的血清型15B荚膜多糖如在图1中所示，血清型15B的多糖重复单元由分支的三糖主链(一个N-乙酰葡糖胺(GlcpNAc)、一个吡喃半乳糖(Galp)和一个吡喃葡萄糖(Glcp))与连接于GlcpNAc的C4羟基的αGalp-βGalp二糖分支组成。磷酸甘油连接到二糖分支中βGalp残基的C3羟基。血清型本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖，每mM所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM乙酸盐。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.21 US 61/929,5611.分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖，每mM所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM乙酸盐。2.分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖，其具有5kDa-500kDa的分子量。3.根据权利要求2的多糖，其具有100kDa-350kDa的分子量。4.分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖，每mM所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM甘油。5.根据权利要求1-4任一项的多糖，每mM所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM乙酸盐。6.根据权利要求1-5任一项的多糖，每mM所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM甘油。7.免疫原性缀合物，其包含共价连接到载体蛋白的根据权利要求1-6任一项的分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖。8.根据权利要求7的免疫原性缀合物，其中所述载体蛋白是CRM197。9.根据权利要求7或8的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物包含相比血清型15B荚膜多糖的总量小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离血清型15B荚膜多糖。10.根据权利要求7-9任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物包含相比血清型15B荚膜多糖的总量小于约40％的游离血清型15B荚膜多糖。11.根据权利要求7-10任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物包含相比血清型15B荚膜多糖的总量小于约20％的游离血清型15B荚膜多糖。12.根据权利要求7-11任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物具有3000-20000kDa、8000-20000kDa、8000-16000KDa或10000-16000KDa的分子量。13.根据权利要求7-12任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物具有10000-16000KDa的分子量。14.根据权利要求7-13任一项的免疫原性缀合物，其中缀合物中血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的比例是0.4-2。15.根据权利要求7-13任一项的免疫原性缀合物，其中缀合物中血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的比例是0.7-0.9。16.根据权利要求7-15任一项的免疫原性缀合物，其中至少40％的免疫原性缀合物在CL-4B柱中具有小于或等于0.3的Kd。17.根据权利要求7-15任一项的免疫原性缀合物，其中至少50％的免疫原性缀合物在CL-4B柱中具有小于或等于0.3的Kd。18.根据权利要求7-15任一项的免疫原性缀合物，其中至少60％的免疫原性缀合物在CL-4B柱中具有小于或等于0.3的Kd。19.根据权利要求7-17任一项的免疫原性缀合物，其中缀合度是2-15、2-13、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、3-15、3-13、3-10、3-8、3-6、3-5、3-4、5-15、5-10、8-15、8-12、10-15或10-12。20.根据权利要求7-17任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合度是2-6。21.根据权利要求7-17任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合度是3-5。22.免疫原性组合物，其包含根据权利要求7-21任一项的免疫原性缀合物和生理上可接受的媒介物。23.根据权利要求22的免疫原性组合物，其进一步包含至少一种额外的抗原。24.根据权利要求22或23的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。25.根据权利要求24的免疫原性组合物，其中所述佐剂是磷酸铝。26.包含根据权利要求22-25任一项的免疫原性组合物的疫苗。27.生产根据权利要求1-6任一项的多糖的方法，所述方法包括下列步骤：(a)制备血清型15B肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；(b)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；(c)从发酵培养物纯化肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖；(d)通过高压均质裁剪纯化的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖。28.用于生产活化的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的方法，所述方法包括使权利要求1-6任一项的分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖与氧化剂反应的步骤。29.根据权利要求28的方法，其中所述方法包括使所述分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖与0.1-0.3摩尔当量的高碘酸钠反应，在20-25℃的温度持续15-20小时。30.活化的血清型15B荚膜多糖，其通过权利要求28或29的方法获得或可通过权利要求28或29的方法获得。31.活化的血清型15B荚膜多糖，其具有约5-500kDa、约50-450kDa、约100-400kDa、约100-350kDa、约100-300kDa的分子量。32.根据权利要求31的活化的多糖，每mM所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM乙酸盐。33.根据权利要求31的活化的多糖，每mM所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM乙酸盐。34.根据权利要求31-33任一项的活化的多糖，每mM所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM甘油。35.根据权利要求31-34任一项的活化的多糖，每mM所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM甘油。36.根据权利要求31-35任一项的活化的多糖，其特征在于氧化度是2-20、2-15、2-10、2-5、5-20、5-15、5-10、10-20、10-15、或15-20。37.根据权利要求31-36任一项的活化的多糖，其特征在于氧化度是5-15。38.根据权利要求31-36任一项的活化的多糖，其特征在于氧化度是10-20。39.根据权利要求31-36任一项的活化的多糖，其特征在于氧化度是15-20。40.根据权利要求31-36任一项的活化的多糖，其特征在于氧化度是10-15。41.包含共价连接到载体蛋白的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的免疫原性缀合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：(a)混合权利要求30-40任一项的活化的多糖与载体蛋白；和(b)使所述混合的活化的多糖和载体蛋白与还原剂反应以形成血清型15B荚膜多糖-载体蛋白缀合物。42.根据权利要求41的方法，其中所述载体蛋白是CRM197。43.根据权利要求41或42的方法，其中步骤(a)和步骤(b)在DMSO中进行。44.根据权利要求41或42的方法，其中步骤(a)和步骤(b)在水溶液中进行。45.根据权利要求41-44任一项的方法，其中步骤(b)中活化的血...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·韩，A·K·普雷萨德，D·库泊，W·J·沃特森，
申请(专利权)人：辉瑞大药厂，
类型：发明
国别省市：美国;US