一种BMP‑9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型制造技术

本发明专利技术公开了一种BMP‑9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型，取6月龄Sprague‑Dawley雌性大鼠64只；12h更替黑夜和白昼，环境温度22℃，自由摄食饮水，喂养啮齿类动物标准饲料，每笼4只，适应性喂养7d后进行动物实验；制作骨质疏松大鼠模型后按完全随机区组设计分为：单纯螺钉固定组、Aln组、BMP‑9转染组、BMP‑9转染+Aln组，每组16只；在螺钉植入后4w、8w每组各处死8只大鼠，进行实验指标检测。本发明专利技术BMP‑9基因结合Aln能显著提高螺钉周围的骨量，提高螺钉的抗拔出能力，提高骨与螺钉的接触率；在增加金属内植物周围骨组织量、增加与骨的接触方面具有交互作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于骨质疏松内固定
，尤其涉及一种BMP-9基因结合阿伦磷酸钠(AlendronateAln)对骨质疏松内固定的模型。
技术介绍
骨质疏松时，患者的骨代谢处于高转换状态，骨的生物机械强度减低，骨脆性增加，在需要行植入物内固定手术时，钻孔或螺钉、假体的植入容易引起细微骨折和局部热损伤，诱发早期内植物周围的炎性反应，使破骨细胞聚集增多，引起骨溶解或骨吸收发生，而骨质疏松患者体内自身修复的因子表达缺乏，骨修复作用降低，最终导致螺钉松动，假体的移位、下沉，手术失败。近年来，内植物-骨界面的稳定性研究主要集中在对内植物设计和对内植物表面的修饰处理上，如通过螺钉接骨板的锁定机制提高螺钉骨界面抗拔出性能，减少早期螺钉切割，或通过植入假体表面羟基磷灰石涂层，增加骨长入。虽然可在一定程度上减少内固定的失败，但提高内植物周围骨质量，增强内植物-骨界面固定强度才是最终的解决办法。研究发现，内植物植入骨内后，周围骨组织结构的改建，涉及众多细胞类型参与及不同因子的调节，类似于骨折的修复。而骨折的修复，BMP(bonemorphogeneticproteins，BMP)起着关键作用。BMP是早期诱导骨组织形成与发生的重要信号分子，可诱导未分化的间充质干细胞分化为成骨细胞，在维持骨的矿物质含量和骨改建方面起着重要作用。在目前已知的30多种BMP中，BMP-9诱导成骨作用最强。通过外源性BMP局部给药促进骨再生，具有持续时间短、用量大、反复追加用药、成本高等缺点。为克服此缺点，将转基因技术将目的基因导入种子细胞，使其在植入部位持续表达，达到治疗的目的。阿伦磷酸钠(AlendronateAln)是临床常用抗骨质疏松药，其抗骨质疏松主要作用机制是抑制破骨细胞前体细胞向骨骼表面游走和募集，并可抑制它们继续向多核细胞分化。同时使成熟的破骨细胞形态改变、功能丧失，并促进破骨细胞的凋亡。阿仑磷酸纳除抑制破骨细胞引起的骨吸收外，对成骨细胞也有促进作用。骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)具有来源丰富、易于取材，具有强大的增殖及多细胞分化潜能，并且低免疫原性和免疫调节作用，已广泛作为基因治疗的载体细胞。目前在BMP-9基因转染结合Aln治疗对骨质疏松状态下金属骨内植物稳定性作用的影响上还没有相关资料进行报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种BMP-9基因结合Aln对增强骨质疏松内固定的模型，旨在评估BMP-9基因转染结合Aln治疗对骨质疏松状态下金属骨内植物稳定性作用的影响问题。本专利技术是这样实现的，BMP-9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型为6月龄Sprague-Dawley雌性大鼠64只，体重275±25g，SPF级；管理饲养，12h更替黑夜和白昼，环境温度22℃，自由摄食饮水，喂养啮齿类动物标准饲料，每笼4只，适应性喂养7d后进行动物实验；大鼠按完全随机区组设计分为：单纯螺钉固定组、阿伦磷酸钠组、BMP-9转染组、BMP-9转染+阿伦磷酸钠组，每组16只，在螺钉植入后4w、8w每组各处死8只大鼠，进行实验指标检测。本专利技术的另一目的在于提供一种所述BMP-9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型的建立方法，所述建立方法包括以下步骤：大鼠称重后，用3.5％水合氯醛按1ml/100g体重腹腔内注射麻醉，待麻醉显效后，手术区备皮，取俯卧位，将大鼠四肢固定在手术台上，以碘伏消毒手术区，铺无菌单；以大鼠背侧骶前横突最长处近端1cm为中心，延正中线作长约1.0cm—1.5cm的纵向皮肤切口，先将皮肤切口向右侧牵拉，显露腹肌在背侧止点，延其止点用眼科剪剪开，于骶脊肌外侧缘可见腹膜内一乳白色发亮脂肪团，用血管钳将脂肪团轻轻夹出切口，在脂肪团内可见一绿豆大小棕黄色卵巢及相连输卵管，有时可见卵巢表面黄色卵泡，用止血钳夹住卵巢，用0号丝线距卵巢约0.5cm处结扎输卵管，切除卵巢，将余下部分回纳入腹腔，缝合肌肉附着点。将皮肤切口牵向左侧，用同样方法切除左侧卵巢；缝合皮肤，碘伏再次消毒切口。将所切除的卵巢组织用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，行显微镜观察，确定所切组织为卵巢。术后放入笼中，常规喂养三个月。进一步，所述建立方法还包括螺钉植入模型建立方法，具体包括：3.5％水合氯醛麻醉，显效后，双侧膝内外侧区备皮，将大鼠取仰卧位，四肢固定于自制操作台上，术区碘伏消毒铺巾；于右侧膝下内侧切开皮肤，长1cm，显露胫骨平台内侧，用尖刀剥离表面骨膜，辨清平台上缘及胫骨前后缘，于距平台上缘3mm，前后缘中点处以Φ1.2mm空针头开口，以Φ1.2mm钻头钻深约4mm，放入明胶海绵，植入Φ1.5mm*4mm钛螺钉，缝合皮肤。本专利技术的另一目的在于提供一种所述BMP-9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型的应用，所述应用包括：利用HEK293细胞扩增获取高滴度的重组腺病毒BMP-9，不同滴度转染大鼠BMSCs，当MOI值为100时，Ad-BMP-9腺病毒转染BMSCs，BMP-9稳定表达，Ad-BMP-9腺病毒转染大鼠BMSCs的转染效率为80％～90％，细胞的增殖不受转染影响；64只6月龄SD大鼠随机分成4组，每组16只：单纯螺钉固定组、阿伦磷酸钠组、BMP-9转染组、BMP-9转染+阿伦磷酸钠组；双侧卵巢切除后3月制作骨质疏松模型，分别于双侧胫骨近心端植入螺钉，BMP-9组和BMP-9+Aln组同时植入转染有BMP-9的BMSCs；在螺钉植入后即刻，Aln组和BMP-9+Aln组分别以1ml/kg皮下注射Aln，每周2次；其余组分别皮下注射等量生理盐水。在螺钉植入后4w、8w每组各处死8只大鼠，进行生物力学测定、Micro-CT扫描、硬组织切片V-G染色、脱钙骨BMP-9免疫组化染色。本专利技术提供的BMP-9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型，Aln与BMP-9联合使用具有协同促进成骨的作用，并且Aln能抑制BMP-9对破骨细胞调节的正面作用，抑制BMP-9诱导BMSc向破骨样细胞分化。因此，本部分研究主要是通过建立大鼠骨质疏松模型，在体内研究BMP-9结合二磷酸盐治疗对内植物固定作用的影响。4w、8w时BMP-9+Aln组螺钉拔出力比Control组提高1倍多，比单纯BMP-9组和Aln组也有显著升高(P<0.01)；Micro-CT结果显示BMP-9+Aln组BV/TV、TB.TH、Tb.N升高分别是Control组的4倍、1倍、2倍左右，但Tb.Sp不到Control组的一半(P<0.01)，Aln组和BMP-9组BV/TV、TB.TH、Tb.N也明显增加，但效果较BMP-9+Aln组差，Tb.Sp降低也差于BMP-9+Aln组。硬组织切片V-G染色显示4w时，BMP-9+Aln组螺钉螺纹间可见大量骨组织长入，周围也有较多骨质形成，其螺钉与骨的接触率比Control组多近2倍(P<0.01)，Aln组和BMP-9组螺纹间也有部分骨质长入，BMP-9显著多于Aln组(P<0.01)，但螺钉周围骨组织量要少于Aln组；8w时，与Control组相比，各组间均有较多骨组织形成，螺纹间骨质长入增多，以BMP-9+Aln组最明显，其螺钉与骨的接触率比Contro本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种BMP‑9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型，其特征在于，所述BMP‑9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型为：6月龄Sprague‑Dawley雌性大鼠64只，体重275±25g，SPF级；管理饲养，12h更替黑夜和白昼，环境温度22℃，自由摄食饮水，喂养啮齿类动物标准饲料，每笼4只，适应性喂养7d后进行动物实验；大鼠按完全随机区组设计分为：单纯螺钉固定组、阿伦磷酸钠组、BMP‑9转染组、BMP‑9转染+阿伦磷酸钠组，每组16只；在螺钉植入后4w、8w每组各处死8只大鼠，进行实验指标检测。

【技术特征摘要】
1.一种BMP-9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型，其特征在于，所述BMP-9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型为：6月龄Sprague-Dawley雌性大鼠64只，体重275±25g，SPF级；管理饲养，12h更替黑夜和白昼，环境温度22℃，自由摄食饮水，喂养啮齿类动物标准饲料，每笼4只，适应性喂养7d后进行动物实验；大鼠按完全随机区组设计分为：单纯螺钉固定组、阿伦磷酸钠组、BMP-9转染组、BMP-9转染+阿伦磷酸钠组，每组16只；在螺钉植入后4w、8w每组各处死8只大鼠，进行实验指标检测。2.一种如权利要求1所述BMP-9基因结合Aln对骨质疏松内固定的模型的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括以下步骤：大鼠称重后，用3.5％水合氯醛按1ml/100g体重腹腔内注射麻醉，待麻醉显效后，手术区备皮，取俯卧位，将大鼠四肢固定在手术台上，以碘伏消毒手术区，铺无菌单；以大鼠背侧骶前横突最长处近端1cm为中心，延正中线作长约1.0cm—1.5cm的纵向皮肤切口，先将皮肤切口向右侧牵拉，显露腹肌在背侧止点，延其止点用眼科剪剪开，于骶脊肌外侧缘可见腹膜内一乳白色发亮脂肪团，用血管钳将脂肪团轻轻夹出切口，在脂肪团内可见一绿豆大小棕黄色卵巢及相连输卵管，有时可见卵巢表面黄色卵泡，用止血钳夹住卵巢，用0号丝线距卵巢约0.5cm处结扎输卵管，切除卵巢，将余下部分回纳入腹腔，缝合肌肉附着点，将皮肤切口牵向左侧，用同样方法切除左侧卵巢；缝合皮肤，碘伏再次消毒切口，将所切除的卵巢组织用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，行显微镜观察，确定所切组织为卵巢，术后放入笼中...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡侦明，赵军，郝杰，沈皆亮，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50