本发明专利技术公开了一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，在心脏干细胞诱导培养液中添加定向分化诱导因子，使定向分化诱导因子作用于培养的心脏干细胞，诱导其定向分化为心肌细胞；所述定向分化诱导因子为一种序列如SEQ ID NO.1所示的外源性多肽。本发明专利技术提供的方法通过在心脏干细胞诱导培养液中添加如SEQIDNO.1所示的定向分化诱导因子，使定向分化诱导因子作用于培养的心脏干细胞，可以有效诱导其定向分化为心肌细胞。实验结果显示分化的细胞表达肌钙蛋白T/肌钙蛋白I、β‑肌球蛋白重链(β‑MHC)等心肌细胞特异性蛋白。序列如SEQ ID NO.2‑4的辅助因子A、B、C对定向分化诱导因子的诱导能力具有明显的强化作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及干细胞的诱导分化，具体涉及一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法。
技术介绍
世界心脏联盟分析预计，2020年全球心血管疾病(CardiovascμLarDiseases，CVD)死亡率将增加50％，心肌梗死将成为人类的第一位死亡因素，严重威胁着人类的健康，同时给社会造成了巨大的经济负担。随着我国老龄化的加快，心血管疾病的发病率和死亡率逐年升高。目前对心血管疾病特别是心肌梗死及缺血性心肌病的治疗主要有药物、介入、外科冠脉搭桥和心脏移植治疗等方法。药物治疗可在一定程度上改善症状；经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)可以开通闭塞血管，使心肌细胞血液供应改善，挽救濒临死亡的心肌细胞，急性心肌梗死后直接PCI术治疗能达到很好的临床效果；外科冠脉搭桥治疗通过移植的血管可改善闭塞血管远端心肌细胞的血液供应，显著改善心脏功能和临床症状。但是上述治疗方案均不能从根本上解决心肌缺血梗死后心肌细胞丧失的问题。心脏移植可从根本上改善症状和心脏功能，但是存在免疫排斥、费用昂贵、供体有限等问题，不能满足临床需求。近些年随着干细胞技术的深入发展，干细胞移植已成为一种新型治疗心血管疾病的方法，包括脂肪、骨髓、脐带血等组织来源的各类间充质干细胞(MSC)、胚胎干细胞(ESCs)和骨骼肌成肌细胞、多能诱导干细胞(IPS)等，这些干细胞移植到心脏可以分化成心肌细胞或者通过分泌细胞因子修复受损心肌细胞起到治疗作用。但是这些心脏组织以外组织来源的干细胞在应用过程中存在很多不足之处，在体内、外研究中很难观察到功能完全的心肌细胞；同时多种干细胞所致恶性心律失常、致瘤、致畸性等问题还不甚明确。目前的研究显示，心脏干细胞具有自我更新、克隆形成、多向分化潜能，自体心脏干细胞移植可从根本上避免了免疫排斥反应、伦理问题、同时因其与心脏细胞有相同的遗传背景，致瘤和心律失常的发生率较低，将成为治疗心血管疾病理想的方案。大量的动物实验研究显示心脏干细胞移植到梗死的心脏可以分化生成新的心肌细胞，减少心脏梗死瘢痕面积、改善心脏重构、提高心脏功能。心脏干细胞因其独特的来源和性能将成为治疗心血管疾病理想的种子细胞。遗憾的是，心脏干细胞移植后定向分化为心肌细胞的分化率较低，这是心脏干细胞移植进一步发展必须克服的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，以提高心脏干细胞定向分化为心肌细胞的分化率，为心脏干细胞移植创造条件。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，在心脏干细胞诱导培养液中添加定向分化诱导因子，使定向分化诱导因子作用于培养的心脏干细胞，诱导其定向分化为心肌细胞；所述定向分化诱导因子为一种序列如SEQIDNO.1所示的外源性多肽。优选地，所述心脏干细胞诱导培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，该培养基中还添加有谷氨酰胺、青霉素和链霉素。优选地，所述培养基中还添加1-3mmol/L谷氨酰胺、80-120U/mL青霉素和80-120μg/mL链霉素。当然，该培养基中含有所述定向分化诱导因子。优选地，所述定向分化诱导因子作用于心脏干细胞的浓度为6-14μmol/L。优选地，还可以在诱导培养液中添加序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3或SEQIDNO.4的辅助因子，浓度为0.4-0.8μmol/L。这些辅助因子本身不具有诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的能力，但是可以强化上述定向分化诱导因子的诱导能力。优选地，所述心脏干细胞经过分离培养、纯化后再经定向分化诱导因子诱导分化。优选地，所述心脏干细胞的分离培养方法包括如下所述的步骤：步骤S1，切取部分右心耳组织，去除脂肪和血迹，用预冷的D-PBS缓冲液冲洗3-5次，将组织块剪成组织碎块，用预冷的D-PBS缓冲液冲洗至液体澄清；步骤S2，把组织碎块移入无菌离心管中，加入适量的0.1％Ⅱ型胶原酶，37℃水浴锅中震荡消化1h；用无菌滴管轻轻吹打消化后的组织块，使细胞从疏松的组织块中脱落，然后置于冰块中静止10min，使未消化的组织块沉淀在离心管底部；移上清到无菌离心管中，1200rpm离心5min；弃去上清液，加入预先配好的新鲜心脏干细胞培养液重悬细胞，接种到T25培养瓶中，置于37℃含5％CO2的恒温孵箱中培养；所述心脏干细胞培养液为含10％胎牛血清的Ham'sF12培养液，其中含有0.2mmol/mLL-谷氨酰胺和10ng/mLHumanβ-FGF；步骤S3，第2d加入新的心脏干细胞培养液进行换液，以后每隔1d换液1次，等细胞融合到80％-90％进行传代；传代时，先用PBS洗涤3次，室温下加入1mL0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA消化，在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后，加入心脏干细胞培养液终止消化，用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液，把细胞悬液移入无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃上清后加入心脏干细胞培养液用滴管反复吹打形成单细胞悬液，按1:2-1:3的比例接种到T25培养瓶中培养，以后4-5d传代一次。优选地，心脏干细胞的纯化方法包括如下所述的步骤：步骤S1，选2-4代传代细胞，等细胞融合到85％-95％时，弃去培养液，用无菌PBS洗涤3次，室温下加入1mL0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA消化，在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后，加入心脏干细胞培养液终止消化，用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液，把细胞悬液移入无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃上清后用PBS重悬洗涤，1000rpm离心5min，反复3次，弃去上清液，加入PBS重悬细胞制成单细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数并调整细胞浓度为106个/mL，加入PE标记的CD117抗体4℃避光孵育30min；不加固定液固定，把PE标记的单细胞悬液上样于流式细胞仪，无菌分选出PE标记的c-kit+CSCs；步骤S2，无菌分选出的c-kit+CSCs收集到添加1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的心脏干细胞培养液中，1000rpm离心5min，弃上清，加入添加1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的心脏干细胞培养液中重悬细胞，接种到6孔板或者T25细胞培养瓶中培养；步骤S3，第2d完全换液，以后隔2d换液一次，换液2次后改换不含青霉素和链霉素的心脏干细胞培养液培养；细胞融合到80％-90％进行传代，方法同上所述。优选地，定向分化诱导因子诱导心脏干细胞分化的方法包括如下所述的步骤：步骤S1，选无菌分选纯化细胞融合85％-95％的c-kit+CSCs，更换成诱导培养液，该诱导培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加有6-14μmol/L定向分化诱导因子、1-3mmol/L谷氨酰胺、80-120U/mL青霉素和80-120μg/mL链霉素；24h后弃去诱导培养液，PBS洗涤2次，更换成不含定向分化诱导因子的诱导培养液继续培养，以后每3d换液1次；步骤S2，诱导结束后，每隔2d更换不含定向分化诱导因子的诱导培养液1次，在含5％CO2的37℃恒温孵箱中培养4W。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的方法通本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，其特征在于：在心脏干细胞诱导培养液中添加定向分化诱导因子，使定向分化诱导因子作用于培养的心脏干细胞，诱导其定向分化为心肌细胞；所述定向分化诱导因子为一种序列如SEQ ID NO.1所示的外源性多肽。
【技术特征摘要】
1.一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，其特征在于：在心脏干细胞诱导培养液中添加定向分化诱导因子，使定向分化诱导因子作用于培养的心脏干细胞，诱导其定向分化为心肌细胞；所述定向分化诱导因子为一种序列如SEQIDNO.1所示的外源性多肽。2.根据权利要求1所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述心脏干细胞诱导培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，该培养基中还添加有谷氨酰胺、青霉素和链霉素。3.根据权利要求2所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述培养基中还添加1-3mmol/L谷氨酰胺、80-120U/mL青霉素和80-120μg/mL链霉素。4.根据权利要求1所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述定向分化诱导因子作用于心脏干细胞的浓度为6-14μmol/L。5.根据权利要求1-4任一所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述心脏干细胞经过分离培养、纯化后再经定向分化诱导因子诱导分化。6.根据权利要求5所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，其特征在于，所述心脏干细胞的分离培养方法包括如下所述的步骤：步骤S1，切取部分右心耳组织，去除脂肪和血迹，用预冷的D-PBS缓冲液冲洗3-5次，将组织块剪成组织碎块，用预冷的D-PBS缓冲液冲洗至液体澄清；步骤S2，把组织碎块移入无菌离心管中，加入适量的0.1％Ⅱ型胶原酶，37℃水浴锅中震荡消化1h；用无菌滴管轻轻吹打消化后的组织块，使细胞从疏松的组织块中脱落，然后置于冰块中静止10min，使未消化的组织块沉淀在离心管底部；移上清到无菌离心管中，1200rpm离心5min；弃去上清液，加入预先配好的新鲜心脏干细胞培养液重悬细胞，接种到T25培养瓶中，置于37℃含5％CO2的恒温孵箱中培养；所述心脏干细胞培养液为含10％胎牛血清的Ham'sF12培养液，其中含有0.2mmol/mLL-谷氨酰胺和10ng/mLHumanβ-FGF；步骤S3，第2d加入新的心脏干细胞培养液进行换液，以后每隔1d换液1次，等细胞融合到80％-90％进行传代；传代时，先用PBS洗涤3次，室温下加入1mL0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA消化，在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后，加入心脏干细胞培养液终止消化，用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液，把细胞悬...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨廷伟，邓凯旋，谷鹏飞，刘翠红，崔长年，陈四海，朱荣富，赵元英，朱晓翔，陈子扬，
申请(专利权)人：青海七彩花生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：青海;63
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