本发明专利技术公开了一种热稳定突变芳香基硫酸酯酶、基因及其应用。利用易错PCR技术引入随机诱变，构建P. carrageenovora芳香基硫酸酯酶突变体库。经过筛选，获得热稳定性提高的突变芳香基硫酸酯酶。结果表明，与WT相比，H260L的热稳定性明显提高。以对硝基苯硫酸钾为底物，H260L的最适反应温度和pH分别为55℃和8.0。H260L在6.0‑9.0的pH范围内稳定。EDTA对突变酶活力有强烈抑制作用，说明金属离子在突变酶的催化过程中起重要作用。H260L对洗涤剂，具有良好的耐受性。H260L对龙须菜粗多糖硫酸基团的脱硫率为82%。本发明专利技术也同时获得了含上述突变芳香基硫酸酯酶基因的基因工程菌，实现了酶的异源表达，为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和酶工程的
，尤其涉及一种热稳定突变芳香基硫酸酯酶、基因及其应用。
技术介绍
琼脂又称琼胶，是一种从海洋红藻中提取的天然多糖，具有优良的胶凝性和增稠性，广泛应用于食品、轻工、医药和生物工程等领域中。红藻中天然琼脂分子上带有大量硫酸酯基团，是影响琼脂凝胶强度、电内渗和蛋白吸附能力的主要原因，去除硫酸酯基团是琼脂生产的必要与关键环节。目前，工业生产中普遍使用碱法去除琼脂中的硫酸酯基团，不仅产生严重的环保问题，还导致琼脂大量降解流失。与碱处理工艺相比，采用酶水解技术去除琼脂中的硫酸酯基团具有反应条件温和、特异性高的特点，对环境污染小，而且不容易引起琼脂降解流失，是新型琼脂生产技术的发展方向。琼脂是典型的热溶性高分子，需要加热到45℃以上才可溶于水，而在43℃以下就可能凝固形成凝胶。此外，琼脂溶液具有较大粘度，其粘度随着温度的降低逐渐升高。这些特性决定了琼脂只有在加热溶解后并保持在45℃以上(使琼脂处于溶解状态下)才能对其进行酶处理。因此，水解琼脂硫酸酯的酶不仅要具有显著的琼脂硫酸酯基团水解活性，还要有良好的热稳定性。芳香基硫酸酯酶(Arylsulfatase)是一种催化裂解硫酸酯键，生成相应的醇和无机硫酸盐的酶。Pseudoalteromonascarrageenovora的芳香基硫酸酯酶具有琼脂硫酸酯的水解活性，能脱除琼脂上的硫酸基团，但酶的热稳定性不高，是影响该硫酸酯酶去除琼脂硫酸酯效率的最主要性质缺陷。有鉴于此，本专利技术人在前期建立了P.carrageenovora芳香基硫酸酯酶克隆表达技术的基础上，采用定向进化的技术对该酶进行改造，进化酶的热稳定性，研究和设计了一种突变芳香基硫酸酯酶、基因及其应用，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种热稳定突变芳香基硫酸酯酶、基因及其应用。为了实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采取的技术方案是：一种编码突变芳香基硫酸酯酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。基因大小为987bp。一种突变芳香基硫酸酯酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。该蛋白编码328个氨基酸残基。一种突变芳香基硫酸酯酶表达载体，含有所述的芳香基硫酸酯酶H260L基因的表达载体pET-28a-ars。一种重组突变芳香基硫酸酯酶的制备方法，包括采用所述的突变芳香基硫酸酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组突变芳香基硫酸酯酶。作为实施例的优选方式，所述的寄主细胞为大肠杆菌。作为实施例的优选方式，包括采用所述的芳香基硫酸酯酶表达载体转化至寄主细胞大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，得到可溶性表达的重组突变芳香基硫酸酯酶。作为实施例的优选方式，所述的IPTG终浓度为0.05mmol/L，诱导温度为25℃。一种重组突变芳香基硫酸酯酶，包括采用所述的突变芳香基硫酸酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酶。作为实施例的优选方式，该突变芳香基硫酸酯酶催化水解的温度范围为30～80℃，最适温度为55℃；所述的水解pH范围为5.0～10.0，最适pH为8.0。该突变酶在45、50、55和60℃处理30min后，分别保留了87％、88％、62％和18％的剩余活力。在pH6.0～9.0条件下处理1h，酶蛋白仍可保持70％以上的相对活力。EDTA可抑制重组酶的活性，说明金属离子在突变酶的催化过程中起重要作用。突变酶对测试使用的一些洗涤剂，包括TritonX-100、Tween20、Tween80和Chaps，具有良好的耐受性。H260L对龙须菜粗多糖硫酸基团的脱硫率为82％。本专利技术通过突变得到芳香基硫酸酯酶热稳定性提高的突变体，可应用于琼脂的酶法提取。同时，本次专利技术也克隆得到了可以大量表达的工程菌，可实现该突变芳香基硫酸酯酶的规模化生产，为后续的工业化应用提供了良好的基础。附图说明图1为芳香基硫酸酯酶H260L的诱导表达及其纯化检测的SDS-PAGE图；其中，M：分子量标准蛋白；1：含pET-28α(+)阴性菌，IPTG诱导；2：含pET-28α-ars阳性菌，未诱导；3：含pET-28α-ars阳性菌，IPTG诱导；4：纯化后的重组蛋白；图2为突变芳香基硫酸酯酶H260L的最适反应温度曲线图；图3为突变芳香基硫酸酯酶H260L的最适反应pH曲线图；图4为突变芳香基硫酸酯酶H260L的热稳定性曲线图；图5为突变芳香基硫酸酯酶H260L的pH稳定性曲线图。具体实施方式实施例1：热稳定性提高突变芳香基硫酸酯酶的筛选以含有野生型Pseudoalteromonascarrageenovora芳香基硫酸酯酶基因的重组质粒(WT)为模板，进行易错PCR，扩增芳香基硫酸酯酶：上游引物(SEQIDNO.3)：5′-CGCGGATCCTTTACGTTTAACGGCAGC-3′；下游引物(SEQIDNO.4)：5′-CCCAAGCTTGCGTTTTAGTTCGTAAC-3′；50μL扩增体系包含：5μL10×缓冲液，0.2μmol/L引物，0.5μmol/LdTTP，0.5μmol/LdGTP，0.1μmol/LdATP，0.1μmol/LdCTP，1UrTaq聚合酶，7mmol/LMgCl2和2ng含野生型酶基因的重组质粒模板。PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃45sec，72℃，1min30个循环；72℃10min。采用酶切克隆的方法构建重组表达质粒，即用BamHI和HindIII双酶切PCR产物，割胶回收酶切后的片段，与同样经BamHI和HindIII双酶切的质粒pET-28a(+)进行连接。采用CaCl2转化法，每管E.coliBL21感受态细胞加入2μL连接产物，转化后每管加入0.8mLLB培养基，37℃、50r/min复苏30min。加入3倍体积LB液体培养基中，加入卡那霉素，使其终浓度达到50μg/mL。37℃、180r/min培养5-6h。菌液加入终浓度为20％的甘油，混匀后分装，即为芳香基硫酸酯酶随机突变文库，置于-70℃保存。根据产芳香基硫酸酯酶菌株水解底物对硝基苯硫酸钾(p-NPS)的显色反应来进行突变文库的初筛。来自于文库的菌株平板经过50℃处理2h后，用含p-NPS的软琼脂覆盖，其中野生型(WT)无显色反应，具有显色反应的菌落认为是热稳定性提高的突变株。菌株过夜培养后，按体积比1：100转接到5mLLB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)中，37℃、180r/min培养至OD600达到0.6–0.8，加入终浓度为0.05mmol/LIPTG，25℃、180r/min培养10h。离心收集菌体，重悬于50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)中，在冰上进行超声波破碎处理，获得粗酶液。粗酶液在50℃处理2h后，以p-NPS为底物，检测酶的残余活力，进行复筛验证。经过初筛与复筛，最终得到一株热稳定性提高的突变株。基因测序分析显示，突变芳香基硫酸酯酶与野生型芳香基硫酸酯酶相比，酶基因序列中有一个碱基被替换，导致酶有一个氨基酸残基发生改变，即260位的组氨酸(H)突变成亮氨酸(L)。该突变芳香基硫酸酯酶命名为H260L。实施例2：利用重组表达菌株表达和纯化重组本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码突变芳香基硫酸酯酶H260L的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
2016.08.05 CN 20161063555521.一种编码突变芳香基硫酸酯酶H260L的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种突变芳香基硫酸酯酶H260L，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种芳香基硫酸酯酶表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的编码突变芳香基硫酸酯酶H260L的基因的表达载体pET-28a-ars。4.一种重组突变芳香基硫酸酯酶的制备方法，其特征在于：包括采用权利要求3所述的突变芳香基硫酸酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组突变芳香基硫酸酯酶。5.根据权利要求4所述的一种重组突变芳香基硫酸酯酶的制备方法，其特征在于：所述的寄主细胞为大肠杆菌。6.根据权利要求5所述的一种重组突变芳香基硫酸酯酶的制备方法，其特征在于：包括采用所述的突变芳香基硫酸酯酶表达载体转化至寄主细胞大肠...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱艳冰，乔超超，倪辉，肖安风，杨远帆，李利君，杜希萍，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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