一种全人源的抗人死亡受体5的激动剂单链抗体及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可特异性结合并激活人死亡受体5（DR5）的单链抗体，属于一种全人源抗体。该单链抗体是通过以人死亡受体DR5胞外区蛋白为靶抗原，从高容量的全人源噬菌体抗体库中经五轮筛选获得的。它可通过在大肠杆菌中诱导表达并经镍离子亲和层析及分子排阻层析纯化得到。药效学实验证明，该单链抗体可有效抑制DR5阳性的结肠癌细胞COLO205和乳腺癌细胞MDA‑MB‑231的生长。该单链抗体本身及改造成其它的抗体形式，包括全长化的、双特异性的或融合蛋白等，可作为药物用于死亡受体DR5阳性的肿瘤靶向治疗。该单链抗体具有免疫源性低、特异性强、穿透性强等优点，是一种理想的靶向肿瘤治疗药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程制药领域，涉及全人源抗人死亡受体5(deathreceptor5，DR5)的单链抗体筛选、鉴定、表达和纯化，及其在肿瘤靶向治疗中的应用。专利技术背景肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligand，也称APO2L)是肿瘤坏死因子超家族的成员，含281个氨基酸，与其他TNF超家族成员一样，TRAIL是II型跨膜蛋白，包含N端的跨膜区域和C端的胞外区域[NaganeM.，etal.Neuro-oncology2010，12(7)：687-700]。TRAIL在体内仅以膜结合型存在，但胞外区域可以通过基因工程方法以可溶形式表达出来并保持一定的活性。目前已知TRAIL在体外均能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，作用范围广。体外实验表明，无论膜结合型TRAIL，还是单独以可溶形式存在的胞外区截断型TRAIL，都能迅速诱导多种细胞表面具有TRAIL特异性受体的肿瘤细胞发生凋亡[FanQ.，etal.SciRep.2013，3：3565]。体内外实验表明，TRAIL与死亡受体结合可选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对大多数正常细胞无明显的杀伤作用[SubbiahV.，etal.MolCancerTher2012，11(11)：2541-2546]，因此受到广泛关注。TRAIL可选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对大多数正常细胞无明显的杀伤作用的机制，目前主流观点认为是由于TRAIL有四种膜结合受体，分别是两种死亡受体DR4、DR5，大多分布于肿瘤细胞表面；两种诱骗受体DcR1、DcR2，大多分布于正常细胞表面。死亡受体的胞内结构包含了死亡结构域，能够介导细胞的凋亡，而DcR1的胞内结构不含死亡结构域，DcR2的死亡结构域被截断，因此两个诱骗受体都不能介导细胞的凋亡[SheridanJ.，etal.Science，1997，277：818-821]。但也正是因为其具有多个结合受体，使得其容易产生耐药性[Sheridan，J.，etal.Science，1997，277:818-821；MerinoD.，etal.Molecularandcellularbiology2006，26(19)：7046-7055]，而且其在体内半衰期短(约30分钟)[HerbstRS.，etal.Journalofclinicaloncology：officialjournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology2010，28(17)：2839-2846]。研究发现，TRAIL对于肝脏细胞存在一定的毒性，而这种毒性的产生主要是由于死亡受体DR4介导的[JoM.，etal.NatMed.2000May；6(5)：564-7；SecchieroP.，etal.Blood.2004Jan15；103(2)：517-22；DiPietroR.，etal.Blood2001，97(9)：2596-2603]。为了克服TRAIL的这些缺点，筛选死亡受体DR5特异性的激活性抗体被认为是一种有效方法[HollandPM.Cytokine&growthfactorreviews2014，25(2)：185-193]。DR5作为一个与TRAIL特异性结合的死亡受体，属I型跨膜蛋白，富含半胱氨酸的结构域及死亡结构域。研究表明，死亡受体DR5高水平地表达于许多肿瘤组织，如结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌、睾丸癌、前列腺癌等[MengRD.，etal.MolTher.2000Feb；1(2)：130-144；NavalJ.，etal.ExpCellRes.2007Jul1；313(11)：2378-2388；El-DeiryWS.，etal.SeminCancerBiol.2003Apr；13(2)：135-147]。由于死亡受体DR5在细胞分布及作用机制的独特性，使其成为抗肿瘤药物开发的理想靶点。2001年Ichikawa制备出人死亡受体DR5特异的激活型单克隆抗体TRA-8，这是特异性针对人细胞膜表面死亡受体DR5而合成的单克隆抗体，它能特异性地与死亡受体DR5相结合，发挥配体的作用，从而诱导细胞凋亡，目前单克隆抗体TRA-8作为抗肿瘤药物也正处于临床研究阶段[KendrickJE.，etal.Gynecologiconcology2008，108(3)：591-597]。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的并具有潜在药用价值的全人源抗人死亡受体DR5的单链抗体。本专利技术通过噬菌体展示技术，以人死亡受体DR5胞外区蛋白做为靶抗原从高容量的全人源噬菌体抗体库中经五轮筛选，获得特征为特异性结合人死亡受体DR5的胞外区，在体外能够激活死亡受体DR5诱导肿瘤细胞凋亡的单链抗体TR2-3。本专利技术具体技术方案如下：一种全人源的抗人死亡受体5的单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区通过柔性肽连接，所述重链可变区包含重链CDR1、CDR2和CDR3域，所述重链CDR1域的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，重链CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；所述轻链可变区包含轻链CDR1、CDR2和CDR3域，所述轻链CDR1域的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，轻链CDR2域的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，轻链CDR3域的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；所述柔性肽氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。所述重链CDR1、CDR2、CDR2域和/或轻链CDR1、CDR2、CDR2域可以是经过氨基酸置换或者修饰后得到的氨基酸序列。优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：2，或者所述重链可变区和轻链可变区被取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本专利技术所述全人源抗死亡受体DR5单链抗体TR2-3基因序列全长735个核苷酸，预期有245个氨基酸。具有122个氨基酸的重链可变区(SEQIDNO：1，见图3)和108个氨基酸的轻链可变区(SEQIDNO：2，见图4)，通过15个氨基酸的柔性肽SEQIDNO.9连接。本专利技术的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述抗死亡受体DR5的单链抗体的方法。全人源单链抗体TR2-3基因连接到表达载体PCANTAB5E，转入大肠杆菌表达宿主HB2151。经0.5mMIPTG、30℃诱导表达20h，利用超声破碎细胞，低温离心去除细胞碎片，将上清液用镍离子亲和层析柱和分子排阻层析柱进行分离纯化单链抗体TR2-3。WesternBlot鉴定分离纯化得到的单链抗体TR2-3。本专利技术的另一目的是提供表达本专利技术所述的全人源的抗人死亡受体5的单链抗体的表达载体和/或宿主细胞。本专利技术的另一目的是提供本专利技术所述的全人源的抗人死亡受体5的单链抗体在制备具有抗肿瘤作用的药物或诊断试剂中的应用。所述肿瘤选自结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌、睾丸癌、前列腺癌等。本专利技术优点：本专利技术提供的一种全人源的抗人死亡受体5的单链抗体通过体外试验表明，该单链抗体对结肠癌细胞COLO205和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全人源的抗人死亡受体5 的单链抗体, 其特征在于包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区通过柔性肽连接，所述重链可变区包含重链CDR1、CDR2和CDR3域，所述重链CDR1域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述轻链可变区包含轻链CDR1、CDR2和CDR3域，所述轻链CDR1域的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链CDR2域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链CDR3域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述柔性肽氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

【技术特征摘要】
1.一种全人源的抗人死亡受体5的单链抗体,其特征在于包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区通过柔性肽连接，所述重链可变区包含重链CDR1、CDR2和CDR3域，所述重链CDR1域的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，重链CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；所述轻链可变区包含轻链CDR1、CDR2和CDR3域，所述轻链CDR1域的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，轻链CDR2域的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，轻链CDR3域的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；所述柔性肽氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。2.如权利要求1所述的全人源的抗人死亡受体5的单链抗体,其特征在于所述重链CDR1、CDR2、CDR2域和/或轻链CDR1、CDR2、CDR2域的氨基酸序列为经过置换或者修饰后得到的同源序列。3.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭树华，雷高新，徐智盼，徐梦龙，陆陈晨，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32