基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米MIR604检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学及生物检测技术领域，具体公开了基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米MIR604检测方法。本发明专利技术针对转基因玉米MIR604的cry3A基因序列的6个区域设计4条特异性引物，其上下游外引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，其上下游内引物序列如SEQ ID NO.3‑4所示。利用环介导等温扩增消光技术使用所述引物对样品的DNA进行扩增，通过反应颜色或吸光值的变化判断是否有扩增产物，从而检测转基因玉米MIR604。本发明专利技术方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、可肉眼判定结果等优点，为转基因玉米MIR604检测提供了有效、快速的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学及生物检测
，具体地说，涉及基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米MIR604检测方法与检测试剂盒。
技术介绍
转基因玉米品系MIR604由瑞士先正达公司2005年研发，具有抗虫特性，采用根瘤农杆菌介导转化方法，转入Cry3A基因，可表达mCry3A抗虫毒蛋白。2007年起，美国、菲律宾、墨西哥、俄罗斯、韩国、日本、加拿大和欧盟相继批准转基因玉米品系MIR604可进口作为食品和饲料的加工原料，美国2012年更是批准其在境内28个州实验种植登记。我国于2008年批准转基因玉米品系MIR604进口作为食品和饲料的加工原料。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplificationmethod,LAMP)是Notomi等于2000年专利技术的一种新型的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在等温条件下(60-65℃)反应，在1h内即可完成核酸扩增反应，目的片段可以扩增109倍。该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、省时、操作简单等优点，在核酸检测方面具有明显优势。目前环介导等温检测技术的产物检测方法主要有浊度法、染料法、电泳法以及核酸试纸条，但是这些方法都容易引起交叉污染。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术建立了一种针对于转基因玉米MIR604的检测方法，本专利技术的一个目的是提供了一套环介导等温扩增技术快速检测用引物；本专利技术的第二个目的是建立了环介导等温扩增检测方法；根据检测方法实现了本专利技术的第三个目的，提供了使用上述检测用引物的试剂盒；本专利技术的试剂盒和检测方法具有简便、灵敏、快速、特异性好等特点，提供了一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米MIR604的检测方法。本专利技术的第一个目的提供一种环介导等温扩增消光技术检测转基因玉米MIR604方法的4条检测引物，序列分别为：上游外引物，MIR604-F3：CTGGGAGGGAGGGAGGGAAGCCCCACCTGTTCGA(SEQIDNO.1)，下游外引物，MIR604-B3：CTGGGAGGGAGGGAGGGGGCTCGCTGCTCTTGTTG(SEQIDNO.2)；上游内引物，MIR604-FIP：AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGCTGGGAGGGAGGGAGGGACCTCACCGCATCCAGTTC(SEQIDNO.3)下游内引物，MIR604-BIP：GGAGCGGCAACTACGTGAGCTGGGAGGGAGGGAGGGAGAAGGGGCTGGTGATGA(SEQIDNO.4)核酶是一种具有类过氧化物酶活性、富含鸟嘌呤的单链DNA分子，在特定的条件下能够折叠成G4重结构，在H2O2存在下能够催化无色底物2,2′-连氮基-双-(3-乙基并二氢噻唑啉-6-磺酸)二价阴离子(ABTS2-)氧化成蓝绿色物质ABTS-·自由基。当存在单链DNA分子的互补链时，这种类过氧化物酶的活性降低甚至消失。将折中显色/消光技术结合到环介导等温扩增技术上，利用引物显色，产物消光的手段，来验证目的片段的存在。本专利技术通过巧妙地设计引物，使引物既可高效扩增转基因玉米MIR604的cry3A基因，又可作为具有类过氧化物酶活性单链DNA分子，实现上述功能。第二方面，本专利技术提供了一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米MIR604的方法，即利用环介导等温扩增消光技术用前述引物对样品的DNA进行扩增，通过检测是否有扩增产物来判断是否存在Cry3A基因，从而判断是否存在转基因玉米MIR604。本专利技术提供的检测转基因玉米MIR604的方法包括以下步骤：(1)提取待测样品基因组模板；(2)显色反应：将hemin工作液与本专利技术SEQIDNO.1-4所述引物混合，添加ABTS显色液和H2O2后得到显色反应混合液，立刻记录颜色或在419nm处测定吸光值；(3)环介导等温扩增消光反应：向显色反应混合液中添加样品基因组模板，在60～65℃进行环介导等温扩增消光反应40～60min；(4)产物检测：目视判定反应颜色，或在419nm处测定吸光值，通过与步骤(2)的结果比较，判断是否有扩增产物，当颜色由蓝色变为浅色或无色或者当OD419nm值变小，说明有目的产物，待测样品为转基因玉米MIR604阳性。步骤(2)中，将40～60μM的hemin工作液与1.25μM的上游外引物和下游外引物以及10μM的上游内引物和下游内引物混合，在35～45℃条件下孵育20～30min，添加30～40mM的ABTS显色液和50～60mM的H2O2后得到显色反应混合液。其中，步骤(3)是向显色反应混合液中添加1.4～2.0mMdNTP、3～8mMMgSO4、0.6～0.8M甜菜碱、3.6～10.0UBstDNA聚合酶大片段、1×Thermopolbuffer，2μL样品基因组模板，再进行环介导等温扩增消光反应。所述hemin工作液由hemin溶于工作液配制，该工作液含有10mMNaH2PO4、100mMKCl、2mMMgCl2以及0.003％TritonX-100。在该显色体系条件下进行显色反应，能够保证引物最大程度的折叠成G4结构，与hemin充分结合，发挥出类过氧化物酶的最大活性，保证显色程度最佳；在该扩增体系条件下进行扩增，能够保证引物的扩增效率不受影响，在短时间内实现快速扩增，保证尽可能多的核酶引物形成双链产物，从而失去类过氧化物酶活性，使得反应体系消光。第三方面，本专利技术提供一种检测转基因玉米MIR604的试剂盒，含有序列如SEQIDNO.1-4所示的引物。进一步地，本专利技术的试剂盒还含有工作液、hemin、ABTS粉剂、DMSO缓冲液、30％H2O2，以及1×Thermopolbuffer、dNTP、MgSO4、甜菜碱组成的反应液和BstDNA聚合酶；所述工作液含有10mMNaH2PO4、100mMKCl、2mMMgCl2以及0.003％TritonX-100。优选地，反应液是由体积比为5:8:1:10的1×Thermopolbuffer、1.4-2.0mMdNTP、3-8mMMgSO4、0.6-0.8M甜菜碱组成。在所述试剂盒中，所述引物以引物混合液的形式存在，所述引物混合液中含有1.25μM的上游外引物MIR604-F3和下游外引物MIR604-B3，含有10μM的上游内引物MIR604-FIP和下游内引物MIR604-BIP。BstDNA聚合酶冻干在PCR管内底部。其中混合液、工作液、ABTS粉剂、DMSO缓冲液、30％H2O2可常温保存，反应液需4℃保存，BstDNA聚合酶需-20℃保存。本专利技术提供了上述试剂盒在检测转基因玉米中的应用。本专利技术的有益效果在于：1、反应快速，一般情况下在15～30min即可有大量的扩增产物生产，为了保证检测的准确度，本专利技术选择反应时长为40min，在此时间内即可将模板扩增109倍，该方法操作简便，适于核酸分子的快速检测。2、特异性好，该技术对靶基因的6个区域设计引物，引物具有更高的特异性。3、灵敏度高，该技术反应速度快，对于痕量目的基因可以达到很好的检测效果，灵敏度比PCR方法高一到两个本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于环介导等温扩增消光技术的检测转基因玉米MIR604的引物，其特征在于，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物，其序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示。

【技术特征摘要】
1.基于环介导等温扩增消光技术的检测转基因玉米MIR604的引物，其特征在于，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物，其序列分别如SEQIDNO.1-4所示。2.权利要求1所述的引物在检测转基因玉米MIR604中的应用。3.一种检测转基因玉米MIR604的方法，其特征在于，利用环介导等温扩增消光技术用权利要求1所述的引物对样品的DNA进行扩增，通过反应颜色或吸光值的变化判断是否有扩增产物，从而检测转基因玉米MIR604。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测样品基因组模板；(2)显色反应：将hemin工作液与权利要求1所述引物混合，添加ABTS显色液和H2O2后得到显色反应混合液，立刻记录颜色或在419nm处测定吸光值；(3)环介导等温扩增消光反应：向显色反应混合液中添加样品基因组模板，在60～65℃进行环介导等温扩增消光反应40～60min；(4)产物检测：目视判定反应颜色，或在419nm处测定吸光值，通过与步骤(2)的结果比较，判断是否有扩增产物，当颜色由蓝色变为浅色或无色或者OD419nm值变小，说明有目的产物，待测样品为转基因玉米MIR604阳性。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将40～60μM的hemin工作液与1.25μM的上游...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云波，黄昆仑，许文涛，徐瑗聪，陈冰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11