一种用于二乙酰精胺(DAS)检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测二乙酰精胺(N1,N12-Diacetylspermine,简称DAS)含量的方法，具体的说是一种用于二乙酰精胺(DAS)含量检测的试剂盒，试剂盒使用的抗原、抗体的制备方法以及试剂盒的研制方法和制备方案。本发明专利技术试剂盒优化了DAS含量检测方法，与传统ELISA方法相比，具有操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响、可大批量样本测试使用等优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测二乙酰精胺(N1,N12-Diacetylspermine,简称DAS)含量的方法，具体的说是一种用于二乙酰精胺(DAS)检测的试剂盒。
技术介绍
大肠癌包括结肠癌和直肠癌，大肠癌在全世界的发病率在恶性肿瘤中排在第三位，在我国的发病率排在第五位，我国男性的肠癌发病率是十万分之十六，女性为十万分之十四，是最常见的肿瘤之一。西方人主要是以结肠为主，70％到80％患者所患为结肠癌，直肠癌患者占20％到30％。我国却相反，直肠癌患者占60％到70％，结肠癌占30％到40％。近年的研究分析发现，我国的直肠癌发病率基本保持不变，结肠癌发病比例却在上升。尽管化疗对转移性结肠癌患者有效，但预后较差。因此，研究制备用于检测结肠癌患者肿瘤标志物含量的试剂盒具有重要的社会意义和科学价值。多胺包括腐胺、尸胺、亚精胺和精胺,是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称。可看作是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质。可以由原核和真核细胞产生。快速生长的组织通常有活跃的多胺合成系统，含有大量的多胺。当体内存在这样的组织时，尿液中多胺的合成会增加。先前的研究表明与健康人相比，癌症患者尿液中多胺的含量增加。然而，后续的研究显示尿液中总的及游离的多胺含量由于产生了大量的假阳性和阴性结果，因而不能作为可靠的肿瘤标志物。DAS分子式为C14H30N4O2，分子量286.41，是一种多胺的二乙酰基衍生物，在体内由鸟氨酸经鸟氨酸脱羧酶作用生成。二乙酰精胺是肿瘤细胞的代谢产物，排泄到尿中。细胞癌变后，乙酰基多胺分泌增加，导致肿瘤患者尿液中二乙酰精胺浓度明显升高。DAS的早期检测是通过高效液相色谱法(HPLC)完成的，后来建立了适用于尿液中DAS含量检测的酶联免疫吸附系统。有研究显示，尿液中DAS表达量的检测可以作为结肠癌、乳腺癌和肝癌有效的新型肿瘤标志物。至此，用于尿液中DAS含量检测的ELISA检测方法得到了广泛的临床研究。但ELISA检测方法同样存在操作复杂，不能批量检测等问题。本专利技术开发的利用全自动生化分析仪检测患者样本中DAS含量的比浊法检测试剂盒，是一种比ELISA检测方法更为方便、快捷的检测技术，能够一次对大量样本进行检测，并且其灵敏度高，操作简单。
技术实现思路
：本专利技术目的在于提供一种二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，包括R1试剂，R2试剂，标准品和质控品，所述R1试剂为将二乙酰精胺抗体偶联在纳米颗粒上，添加保护液后以液体形态或者冻干后的固定形态保存的试剂；所述的R2试剂为将乙酰精胺(DAS)分子通过偶联试剂偶联在载体蛋白上，以液体形态或者冻干后的固体形态保存的试剂。所述二乙酰精胺抗体是以乙酰精胺(DAS)分子通过偶联试剂偶联在载体蛋白上所得的产物作为免疫原，再免疫动物获得多克隆抗体或经筛选获得单克隆抗体。所述R1中保护液按重量百分比计为：0.1-0.5％的Tris、0.5-2％的PVP40、0.5-1％的BSA、0.1-0.5％的PEG20000、2-5％的蔗糖、0.01-0.8％的TWEEN20、0.02-0.1％的叠氮钠、0.85-1.5％的NaCl、1-4％的PEG6000，余量为水。所述的样本包含但不限于血清、血浆、尿液等。所述纳米颗粒包括但不限于纳米金、微球等。所述载体蛋白包括但不限于血清白蛋白(BSA)、多聚赖氨酸、卵清蛋白等。所述偶联试剂为碳二亚酰胺类或马来酰亚胺类；其中，碳二亚酰胺类为EDC,1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)；马来酰亚胺类为4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)。所述二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是：以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)作为偶联试剂，将活化处理后的载体蛋白加入至过量的0.01M-0.1M的pH＝6.5-8.0的PBS中，再加入水溶性的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀至清澈透明，而后室温下静置15-30分钟；静置后加入过量的乙酰精胺，混匀至清澈透明，调节体系PH值至10-12，室温下反应4-6小时；反应后经透析所得产物，即得二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。具体为：所述二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)作为偶联试剂，将活化处理后的6-15mg载体蛋白加入至0.01M-0.1M的pH＝6.5-8.0PBS3-8mL中，再加入水溶性的碳二亚胺(EDC)7-10mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)3-5mg，混匀至清澈透明，而后室温下静置15-30分钟；静置后加入乙酰精胺，混匀至清澈透明，调节体系PH值调至10-12，室温下反应4-6小时；反应后经透析所得产物，即得二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。所述二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是：以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)作为偶联试剂，活化处理后的载体蛋白加入至过量的0.01M-0.1M的pH＝6.5-8.0的PBS中，再加入水溶性的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀至清澈透明，而后室温下静置15-30分钟；静置后加入精胺，混匀至清澈透明，调节体系PH值调至10-12，室温下反应4-6小时；反应后经透析所得产物在2-8℃中，向反应体系内加入的酰化剂，而后再于2-8℃下反应1-3小时，反应物在经透析即得二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。具体为：所述二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是：以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)作为偶联试剂时，将活化处理后的6-15mg载体蛋白加入至0.01M-0.1M的pH＝6.5-8.0PBS3-8mL中，再加入水溶性的碳二亚胺(EDC)7-10mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)3-5mg，混匀至清澈透明，而后室温下静置15-30分钟；静置后加入精胺，混匀至清澈透明，调节体系PH值调至10-12，室温下反应4-6小时；反应后经透析所得产物在2-8℃中，向3-10mL反应体系内加入40μL-80μL的酰化剂，而后再于2-8℃下反应1-3小时，反应物在经透析即得二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。所述二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是以N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯(GMBS)作为偶联试剂，将酰化剂(乙酸酐或无水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，包括R1试剂，R2试剂，标准品和质控品，其特征在于：所述R1试剂为将二乙酰精胺抗体偶联在纳米颗粒上，并添加保护液后，以液体形态或者冻干后的固定形态保存的试剂；所述的R2试剂为将乙酰精胺(DAS)分子通过偶联试剂偶联在载体蛋白上，以液体形态或者冻干后的固体形态保存的试剂。

【技术特征摘要】
1.一种二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，包括R1试剂，R2试剂，标准品和
质控品，其特征在于：所述R1试剂为将二乙酰精胺抗体偶联在纳米颗粒上，并添加保护液
后，以液体形态或者冻干后的固定形态保存的试剂；所述的R2试剂为将乙酰精胺(DAS)分子
通过偶联试剂偶联在载体蛋白上，以液体形态或者冻干后的固体形态保存的试剂。
2.按权利要求1所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于：所
述二乙酰精胺抗体是以乙酰精胺(DAS)分子通过偶联试剂偶联在载体蛋白上所得的产物作
为免疫原，免疫动物得多克隆抗体或经筛选得单克隆抗体。
3.按权利要求1所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于：所
述R1中保护液按重量百分比计为：0.1-0.5％的Tris、0.5-2％的PVP40、0.5-1％的BSA、
0.1-0.5％的PEG20000、2-5％的蔗糖、0.01-0.8％的TWEEN20、0.02-0.1％的叠氮钠、0.85-
1.5％的NaCl、1-4％的PEG6000，余量为水。
4.按权利要求1所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于：所
述偶联试剂为碳二亚酰胺类或马来酰亚胺类；其中，碳二亚酰胺类为EDC,1-乙基-3-(3-二
甲基氨丙基)-碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)；马来酰亚胺类为4-马来酰亚胺
基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯
(SMCC)。
5.按权利要求2或4所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于：
所述二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)作为
偶联试剂，将活化处理后的载体蛋白加入至过量的0.01M-0.1M的pH＝6.5-8.0的PBS中，再
加入水溶性的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀至清澈透明，而后室温下静
置15-30分钟；静置后加入过量的乙酰精胺，混匀至清澈透明...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文欣，朱明光，刘峰，宫晓丽，王帅，
申请(专利权)人：辽宁迈迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21