识别HPV18阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种识别HPV18阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用，该抗体能够高特异性地检测肿瘤细胞中的宫颈癌生物标志HPV18E7蛋白，从而能够区分癌变的宫颈上皮细胞和宫颈异常或非癌变宫颈上皮细胞，为医生准确诊断HPV感染所导致的癌症带来依据，进而及时采取治疗，以防止癌症发生，或癌症扩散，及时减轻病人痛苦。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物诊断及医药领域，具体地说，本专利技术涉及识别HPV18阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
宫颈癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位。1949年，Sttauss首先在电镜下于疣体浸出液中观察到人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)颗粒。在1976年HaraldZurHausen提出HPV可能是性传播致癌因素之后，HPV感染与宫颈癌关系的研究成为肿瘤病毒病因研究的热门课题。大量研究发现,人乳头瘤病毒HPV是导致宫颈癌的元凶，还可以引起多种其它肿瘤,包括生殖道、乳腺、消化道及呼吸道癌症。HPV近年来在我国人群中的传播有增无减，故宫颈癌预防、治疗的研究工作非常重要。大多数妇女在其一生中都会感染生殖器HPV，全世界生殖器HPV感染率高达10.4％。大多数HPV感染在1-2年内会被自身免疫系统所清除，而持续存在的HPV感染将会演变为高度宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia，CIN)损伤，如CIN2和CIN3，甚至进一步演变为宫颈癌。据统计，约20％的低度宫颈损伤将转变为高度损伤，如果不及时治疗，其中30％将会进一步转为为恶性肿瘤。因此，早期诊断和预防HPV感染是降低宫颈癌等相关疾病死亡率和减少宫颈癌治疗开支的重要突破口。目前宫颈癌筛查主要采用的是巴氏涂片检验，检测宫颈脱落细胞的细胞学形态。细胞形态学检测具有一定的主观性，制片困难，批内和批间重复性差，具有较高的假阳性和假阴性率，因此对早期癌症检测灵敏度低、漏诊率高，阳性检出率仅在30％～50％；在一些地区，巴氏涂片检验已经被液基细胞学(LBC)所取代，LBC是半自动或全自动标本处理新技术，能够自动分析检测样本并可提供剩余的细胞样本供其他HPV感染分析。另一种临床上使用广泛的分子检测——HPVDNA检测(如HC2)可以辅助细胞学检测高危HPV病毒的存在。虽然HPVDNA检测比细胞形态学检测灵敏，但是无法区分HPV是瞬时感染或是持续感染，而在肿瘤恶性演变进程中检测方法的灵敏度和特异性都是必须的。由于其不能准确的反映宫颈癌的发生因此不能用于检测癌症(美国和我国2012年底分别更新的宫颈癌筛查指南一致指出“不推荐在任何年龄段的人群中单独使用HPV检测进行筛查”)。HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要。Ziegent(2003)等研究已证实HPVE6、E7基因具有细胞转化功能,是潜在的癌基因,编码HPVE6、E7蛋白为癌蛋白,在体外能转化小鼠上皮细胞,也能使人类上皮细胞发生永生化,而且HPVE6、E7蛋白的持续表达是维持体外培养细胞永生化所必需的。因此，高危型HPV的早期表达蛋白E6和E7在宫颈癌的发生中起着重要作用。癌症发生过程中病毒DNA整合入人体细胞基因组内，随着E6和E7蛋白表达控制的缺失，在高度宫颈非典型增生和宫颈癌病人的上皮细胞内持续表达E6和E7蛋白。E7是肿瘤原性蛋白，且具有较强的抗原性，能够使肿瘤抑癌基因pRb失活，最终引起细胞生长失控，导致细胞永生化而发生癌变。这使得E7可作为高度宫颈损伤和宫颈癌检测的一个肿瘤标志物。目前临床免疫组化检测HPV感染主要是采用HPVL1和其他一些辅助生物标志，如p16INK4A，Ki67,hTERT等(ValentinaF，RenzoB，SerenaB，等,DetectionofHPVE7Oncoviralproteinincervicallesionsbyanewantibody.ApplimmunohistochemMolMorphol,2013,21(4):341-350)。临床HPV检测没有合适的抗体主要有三个原因：1，HPV蛋白在临床组织或细胞样本中表达量较低，需要度高亲和力的抗体进行检测；2，HPV病毒在现有的标准组织培养技术下不能在实验室培养存活；3，E7蛋白本身存在免疫抑制，使得采用E7蛋白免疫动物不能获得很好的免疫反应，另外使制备得到的抗体往往与其他的HPV蛋白存在交叉反应对E7蛋白不具有特异性。因此，需要提供一种简便的、客观的方法来检测高危型HPV感染的癌症(特别是宫颈癌)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够识别HPV18阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.:4所示的CDR1，SEQIDNO.:6所示的CDR2，和SEQIDNO.:8所示的CDR3。在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQIDNO.:10所示的氨基酸序列。本专利技术的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本专利技术第一方面所述的重链可变区，和重链恒定区。在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源。本专利技术的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：SEQIDNO.:14所示的CDR1'，SEQIDNO.:16所示的CDR2'，和SEQIDNO.:18所示的CDR3'。在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQIDNO.:20所示的氨基酸序列。本专利技术的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本专利技术第三方面所述的轻链可变区，和轻链恒定区。在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源或鼠源。本专利技术的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：(1)如本专利技术第一方面所述的重链可变区；和/或(2)如本专利技术第三方面所述的轻链可变区。在另一优选例中，所述抗体具有：如本专利技术第二方面所述的重链；和/或如本专利技术第四方面所述的轻链。在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗HPV的抗体；优选地，所述抗体为特异性抗HPV18的抗体；更优选地，所述抗体为特异性抗HPV18E7蛋白的抗体。在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。在另一优选例中，所述抗体具有以下特性：(1)与HPV18E7蛋白亲和力≤2.67nM；和(2)不与HPV16E7蛋白结合。所述“HPV18E7蛋白”可以为野生型HPV18E7蛋白，也可以为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.:4所示的CDR1，SEQ ID NO.:6所示的CDR2，和SEQ ID NO.:8所示的CDR3；优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个
互补决定区CDR：
SEQIDNO.:4所示的CDR1，
SEQIDNO.:6所示的CDR2，和
SEQIDNO.:8所示的CDR3；
优选地，所述重链可变区具有SEQIDNO.:10所示的氨基酸序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重
链可变区和重链恒定区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区具有选自下组的
互补决定区CDR：
SEQIDNO.:14所示的CDR1'，
SEQIDNO.:16所示的CDR2'，和
SEQIDNO.:18所示的CDR3'；
优选地，所述的轻链可变区具有SEQIDNO.:20所示的氨基酸序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻
链可变区和轻链恒定区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：如权利要求1所述的重链可变
区；和/或如权利要求3所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所
述的轻链。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利
要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的
抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利
要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的
抗体；或
(2)如权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种载体，其特征在于，它含有本发明权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载
体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利
要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：常小迦，施丽君，时成龙，韩凤丽，
申请(专利权)人：艾托金生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32