利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，包括以下步骤：①、待测鱿鱼样品中基因组DNA的提取；②、对常见鱿鱼特异性鉴定引物与探针的设计；4种常见鱿鱼为：北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼以及日本海鱿鱼；③、荧光定量PCR扩增体系设置；以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测；④、根据实时荧光PCR检测结果进行判断。采用本发明专利技术的方法能对鱿鱼以及深加工鱿鱼产品种类进行快速鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种适用于鱿鱼及其深加工产品种类的荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
鱿鱼(Squid)，又称句公、柔鱼或枪乌贼，是头足纲(Cephalopoda)、枪形目(Teuthida)中多种10腕头足类软体动物的俗称。其身体狭长，呈枪形。嗅觉突由两个突起组成，眼眶外覆盖透明角膜，环口附肢10腕。喷水推进能力强，适于快速游泳。鱿鱼广泛分布于世界各大洋，已知分布水层为0～3000m。市场上常见的鱿鱼一般是开眼亚目(Oegopsida)的柔鱼科(Ommastrephidae)品种和闭眼亚目(Myopsida)的枪乌贼科(Loliginidae)品种。在中国本土市场，最常见的鱿鱼是柔鱼科的秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)、阿根廷鱿鱼(Illexargentinus)、日本海鱿鱼(Todarodespacificus)和北太平洋鱿鱼(Ommastrephesbartramii)。鱿鱼类的平均可食用部分约占85％，比一般鱼类高约25％。肉质鲜美，富含蛋白质、牛磺酸、钙、磷、铁等人体必需的成分，且必需氨基酸组成接近全蛋蛋白，营养价值非常高。市场上的鱿鱼除了直接鲜销，还会经加工来供应市场。常见的鱿鱼加工形式有：冻品，如冻鱿鱼胴片、冻鱿鱼圈等；干品，如鱿鱼鲞、鱿鱼耳等；熟食产品，如鱿鱼丝、鱿鱼仔、鱿鱼罐头等。日本和欧盟是鱿鱼的主要消费市场，日本以进口冷冻和干制品为主，欧盟则大部分进口冷冻品。近年来，美国、中国等国家或地区的鱿鱼市场也逐渐扩大。因为产地、营养成分、口味的差异，不同鱿鱼品种的市场价相差巨大。例如，阿根廷鱿鱼肉质肥厚、口感鲜嫩，所以价格较高；秘鲁鱿鱼资源丰富，个体大，但含有特殊酸味且肉质较差，所以价格较低。而当鱿鱼进行切片、熟制等加工过程，其可供鉴别的形态学特征基本不存在，这可能会导致不法商贩以次充好的欺诈行为。虽然很多国家、地区和组织都有相应的法规，规定在水产品的标签中明确其种类和来源，但是掺假造假的判定和标签制度的有效实施，必须是建立在快速、准确的鱿鱼品种鉴定的基础上的。目前该领域国内的研究还在起步阶段。因此，为了规范鱿鱼市场，维护消费者的知情权，迫切需要建立灵敏、可靠的检测方法和检测体系来鉴定鱿鱼类产品原鱼料的品种。目前，已报道的鱿鱼种类鉴定的方法有传统形态学法、蛋白质电泳法和DNA分子遗传标记方法。形态学方法依赖于专业人士的长期工作经验，对亲缘关系相近的相似种的判断并非有效。而且对于市面上常见的加工过鱿鱼产品(鱿鱼丝、罐头等)，可供种类鉴别的形态学特征几乎不存在；蛋白质分析方法不适用于深加工产品，因为产品加工过程中的热处理使蛋白质的生化特性及其结构完整性都被破坏；而基于DNA技术的分子生物学方法，就显示出明显优势：1)DNA比蛋白质耐热性强；尽管DNA在加工过程中也会被降解，但是仍然能提取出小片段的DNA；2)作为生物体的遗传物质，DNA分子能够提供更多信息；3)DNA分子稳定，不受组织类型、年龄及生理状态等因素的影响。DNA分子技术用于种类鉴定有多种常见方法，如限制性片段长度多态性(RFLP)标记、单碱基多态性(SNP)标记、微卫星(microsatellite)标记、DNA条形码技术(DNAbarcode)、荧光定量PCR技术等。RFLP首先需要对目标DNA片段进行PCR扩增，然后选择合适的限制性内切酶切割扩增片段，通过琼脂糖凝胶电泳获得不同物种的限制性酶切片段图谱。该方法花费低，操作简单，但也存在诸多缺点：1)、由于存在种内变异以及不同密码子的简并性特征，同一物种不同个体可能存在不同的限制片段酶切图谱；2)、除生鲜鱿鱼和冷冻鱿鱼外，鱿鱼深加工产品(如鱿鱼丝、鱿鱼饼、鱿鱼罐头等)在加工过程中通常使用长时间(>15min)高温(>115℃)处理，DNA分子常降解为100-200bp的小片段，这可能严重影响酶切片段的多态性的判断。SNP和microsatellite标记常用于鱿鱼类的群体分析。DNAbarcode是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行快速物种鉴定的技术，由Hebert等(2003)首先提出。2003年，海洋生物普查研究首次将DNABarcode技术用于标本编码。2004年，生命条形码联盟(theConsortiumfortheBarcodeofLife,CBOL)成立，支持生物DNA条形码研究的发展。至今，该组织下的鱼类DNA条码(FishBarcodeofLifecampaign,FISH-BOL)已经获得了10267个种的DNA条形码记录,包含97％的鱼类品种。该方法在新物种的发掘和物种系统进化分析方面非常高效，但其缺点是混合样品中通常有多种成分被同时扩增,会造成测序结果的杂乱，因此不适用于混合样品的鉴定。荧光定量PCR技术是近年来发展起来的新的核酸定量检测方法，它在常规的PCR基础上加入荧光信号物质(探针或染料)，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过扩增曲线的Ct值(荧光信号强度达到基础信号(BaseLine)时的循环数，表明PCR开始进入指数扩增期)对未知模板进行定量分析。它集中了核酸杂交特异性强和PCR扩增灵敏度高的优点，检测范围广(≥7个数量级)、检测极限低(1c/r)，可同时对多个样品进行快速准确分析，被认为是目前最可靠的核酸定量检测技术。在我国进出口食品的检验检疫方面，已广泛应用于病原体检测、有害生物风险分析以及转基因产品的监管等多个方面。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探针，采用本专利技术的方法能对鱿鱼以及深加工鱿鱼产品种类进行快速鉴定。为解决上述技术问题，本专利技术提供鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探针，其特征是：所述特异性引物和探针的序列由柔鱼科以及北太平洋鱿鱼(Ommastrephesbartramii)、秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)、阿根廷鱿鱼(Illexargentinus)以及日本海鱿鱼(Todarodespacificus)中的至少任意一种以及柔鱼科组成：具体如表1所述；表1备注说明：上述柔鱼科R-P中：Y:C/T，R:A/G，H：A/T/C。本专利技术还同时提供了利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，包括以下步骤：①、待测鱿鱼样品中基因组DNA的提取；②、对常见鱿鱼特异性鉴定引物与探针的设计；4种常见鱿鱼为：北太平洋鱿鱼(Ommastrephesbartramii)本文档来自技高网...

【技术保护点】
鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探针，其特征是：所述特异性引物和探针的序列由柔鱼科以及北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼以及日本海鱿鱼中的至少任意一种以及柔鱼科组成：

【技术特征摘要】
2016.01.11 CN 20161001511231.鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探
针，其特征是：
所述特异性引物和探针的序列由柔鱼科以及北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼以
及日本海鱿鱼中的至少任意一种以及柔鱼科组成：
2.利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是包括以下步骤：
①、待测鱿鱼样品中基因组DNA的提取；
②、对常见鱿鱼特异性鉴定引物与探针的设计；
4种常见鱿鱼为：北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼以及日本海鱿鱼；
③、荧光定量PCR扩增体系设置；
以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测；
④、根据实时荧光PCR检测结果进行判断。
3.根据权利要求2所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特
征是：
所述步骤②是对4种常见鱿鱼的12SrDNA及Cytb、COI、ATPase6基因的序列进行荧光
定量PCR检测的特异性鉴定引物与探针的设计。
4.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法，其特
征是：
所述探针的5’端标记有报告荧光染料，所述报告荧光染料为FAM、HEX，探针的3’端标记
有淬灭荧光染料，所述淬灭荧光染料为TAMRA。
5.根据权利要求2、3或4所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方
法，其特征是：
所述步骤②中的特异性引物和探针的序列如权利要求1所述。
6.根据权利要求5所述的利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯俊丽，叶剑，戴志远，金仁耀，沈清，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33