用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针及检测方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针，所述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计，引物序列见Seq ID No:1和2。所述探针根据RPA引物设计，大小为46-52bp，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3Spacer修饰，且在探针中间距5’端30bp处进行dSpacer或THF修饰。本发明专利技术还提供含有所述RPA引物和探针的检测试剂盒。本发明专利技术进一步提供基于所述RPA引物和探针建立的检测莱姆病螺旋体的RPA法。本发明专利技术将RPA引物恒温扩增技术与侧流层析试纸联用，可从疑似病人血清中快速准确地检测出莱姆病螺旋体。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR更高，可对不同致病基因型的莱姆病螺旋体进行检测，对莱姆病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针及检测方法。
技术介绍
莱姆病(Lymedisease)是由伯氏疏螺旋体(Bolreliaburgdorferi)引起的一种慢性自然疫源性疾病。该病主要是通过节肢动物蜱的叮咬在宿主动物与宿主动物及人之间传播。莱姆病临床表现初期多有典型皮肤损害--慢性游走性红斑(ECM)，同时伴有头痛、发热、寒战、疲乏不适.局部淋巴结肿大等症状，后期表现为神经系统、循环系统、运动系统等呈间歇性、交替性出现的各种损害。具有分布广、病程长、病死率较高等特点。如能早期诊断、早期治疗常可痊愈，否则会出现严重并发症。因此开发莱姆病螺旋体的早期快速检测技术，对莱姆病早期诊断、早期治疗具有重要的意义。目前莱姆病的主要诊断方法包括病原学检测和特异性抗体检测。病原学检测包括直接镜检法、病原分离培养、多聚酶链反应(PCR)和荧光定量PCR(real-timePCR)；常用的特异性抗体检测包括间接免疫荧光抗体法(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白免疫印迹法(WB)。直接镜检法需要操作者具备丰富的检验经验，然而对于混合感染的情况，则无法检测到，而且该法容易漏检，与其他诊断方法相比，直接检查的检出率相对较低。病原分离培养法的分离率低，耗时较长，敏感性差。IFA只能检测到菌体表面的抗原，灵敏度和特异性都比较低，且IFA受实验因素影响大，易造成假阳性或假阴性。ELISA主要对莱姆病特异抗体IgG进行检测，传统ELISA检测方法，存在非特异反应，虽然灵敏度高，但缺乏特异性，易误诊。WB可以判断和验证IFA和ELISA的真假阳性，但由于莱姆病螺旋体有不同的致病基因型，而这几种基因型在世界各地的分布又有所不同，因此各国应根据实际情况，制定出针对本国流行的基因型的WB阳性诊断标准，而且WB的操作比较复杂，不利于推广。PCR技术的不足之处在于：(1)靶基因易被污染；(2)易出现非特异性扩增；(3)扩增反应易受多种因素的影响；(4)需要投入比较昂贵的精密仪器(如PCR仪、凝胶电泳仪及凝胶成像系统)；(5)耗时长，需要2～3h的反应时间和1～2h的电泳时间。这些均不利于现场的快速检测，给技术的基层推广造成了极大障碍。重组酶聚合酶扩增法(RecombinasePolymeraseAmplification,RPA)是2014年兴起的一种新的恒温扩增方法，其特点是在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶基因序列。目前RPA技术主要应用于病原微生物的快速检测，包括病毒、细菌、真菌、支原体、寄生虫等，在临床疾病诊断、食品卫生检验及环境监测方面应用广泛，然而目前未见利用RPA技术进行莱姆病螺旋体检测的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针以及含有所述引物和探针的检测试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种检测莱姆病螺旋体的RPA法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针，所述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计，引物序列如下：LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’LF-R:5’-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’所述探针根据RPA引物设计，大小为46-52bp，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3Spacer修饰，且在探针中间距5’端30bp处进行dSpacer或THF修饰。引物和探针序列分别如下：LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’LF-R:5’-biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’LF-P:5’-FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAGGAGGCAT(C3Spacer)-3’本专利技术还提供含有所述引物LF-F、LF-R和探针LF-P的用于RPA法检测莱姆病螺旋体的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括RPA反应管、反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种(RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编号TANFO02KIT；其中，BsuDNA聚合酶和重组酶uvaX以干粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用1×反应缓冲液溶解，整个RPA反应在RPA反应管中进行)。本专利技术还提供所述RPA引物和探针及其检测试剂盒在鉴定莱姆病螺旋体中的应用。本专利技术进一步提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA法，包括以下步骤：1)提取样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，使用所述引物LF-F、LF-R和探针LF-P，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；3)分析RPA扩增产物。其中，RPA反应体系以50μl计为：RPA反应条件为：30-45℃(优选37℃)，20分钟，冰上终止反应。步骤3)中采用Hybridetect2T试剂盒(含侧流层析试纸条，购自德国MileniaBiotec公司，商品编号MILENIA01)检测RPA扩增产物。检测方法如下：将扩增产物与Hybridetect2T试剂盒中的缓冲液按1:20的体积比混合，然后将Hybridetect2T试纸条置于上述混合液中，5分钟后判读结果；如果试纸条的检测线上出现条带，而且质控线正常，则表明该样品中含有莱姆病螺旋体，如果仅是质控线上出现条带，则表明该样品中不含莱姆病螺旋体。本专利技术将RPA引物恒温扩增技术与侧流层析试纸联用，可从疑似病人血清中快速准确地检测出莱姆病螺旋体。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR更高，可对不同致病基因型的莱姆病螺旋体进行检测，对莱姆病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。附图说明图1为本专利技术实施例2中利用RPA引物恒温扩增不同基因型的莱姆病螺旋体、非莱姆病螺旋体的Hybridetect2T试纸条检测结果；其中，A图为扩增36株莱姆病螺旋体的结果，对应于表1中各菌株，N为阴性对照；B图为扩增非莱姆病螺旋体的结果，B31为阳性对照，1为埃立克体，2为横赛巴尔通体，3为无形体，4为贝氏柯克斯氏体，5为钩端螺旋体，6为大肠埃希菌，7为阴性对照。图2为本专利技术实施例3中RP本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针，其特征在于，所述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计，引物序列如下：LF‑F:5’‑ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA‑3’LF‑R:5’‑AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA‑3’所述探针根据RPA引物设计，大小为46‑52bp，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3Spacer修饰，且在探针中间距5’端30bp处进行dSpacer或THF修饰。

【技术特征摘要】
1.用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针，其特征在于，所
述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计，引物序列如下：
LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’
LF-R:5’-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’
所述探针根据RPA引物设计，大小为46-52bp，探针的5’端用FAM
标记，3’端进行C3Spacer修饰，且在探针中间距5’端30bp处进行
dSpacer或THF修饰。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，引物和探针
序列分别如下：
LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’
LF-R:5’-biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’
LF-P:5’-FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAA
AAAGAAGGAGGCAT(C3Spacer)-3’。
3.含有权利要求1或2所述引物和探针的用于RPA法检测莱姆病
螺旋体的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包
括...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝琴，刘炜，张琳，侯学霞，刘慧鑫，万康林，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11