具有降低的VWF结合的因子VIII分子制造技术

本发明专利技术涉及一种重组因子VIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力，且其中所述分子与至少一种侧基共价缀合。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2011年2月2日，申请号为201180009856.X的、专利技术名称和本发明相同的专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及重组因子VIII(FVIII)分子。特别地，本专利技术涉及与内源性FVIII相比具有降低的vonWillebrand因子(vWF)结合的FVIII分子。本专利技术还涉及这样的分子的用途以及用于获得这样的分子的方法。专利技术背景A型血友病是由凝血因子VIII(FVIII)活性缺乏或功能异常引起的遗传性出血性疾病。临床表现不是基于初级止血(通常发生血凝块的形成)，而是由于缺乏次级凝血酶形成，凝块不稳定。通过静脉内注射分离自血液或重组产生的凝血因子FVIII治疗该病。当前的治疗推荐正从传统应要求治疗转向预防。与vonWillebrand因子结合的内源性FVIII循环半寿期是12-14小时，因此将进行一周数次的预防治疗以便让患者获得实际上无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和少年，静脉内给药与显著不方便和/或疼痛联系在一起。因此本领域需要新的具有因子VIII活性的因子VIII产品，其优选结构上同源，优选安全并优选具有显著延长的循环半寿期以便降低因子VIII每周给药的次数。此外，本领域中需要相对简单的用于获得和生产这样的分子的方法。专利技术概述本专利技术涉及一种重组因子VIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力，且其中所述分子与至少一种侧基共价缀合。本专利技术还涉及用于制备这样的分子的方法以及这样的分子的用途。这样的分子具有改变的循环半寿期。专利技术详述附图简述图1NNC129-0000-9105和Advate?在FeCl3诱导的FVIII-KO小鼠(n=6-10)损伤模型中的剂量反应关系。*与溶媒处理显著不同。*P<0.05。图2NNC0129-000-9105和Advate?(20和280IU/kg)在FVIII-KO小鼠(n=5-6)的尾巴出血模型中的作用。*与溶媒处理显著不同。*P<0.05。定义：vonWillebrand因子(vWF)：vWF是存在于血浆中的大的单体/多聚体糖蛋白，并基本上在内皮(在怀布尔-帕拉德体中)、巨核细胞(血小板的α-颗粒)和内皮下结缔组织中产生。它的主要功能是与其他蛋白(特别是因子VIII)结合，且它在血小板与伤口部位粘附中重要。当在循环中无活性时，因子VIII与vWF结合；当不与vWF结合时，因子VIII迅速降解或被清除。由此可见，降低或废除vWF在FVIII中的结合能力迄今被认为是获得具有延长循环半寿期的因子FVIII变体的高度不合意的方法。术语“降低的结合vWF的能力”本文意在涵盖其中结合vWF的能力降低至少50%(优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，更优选至少90%和最优选约100%)的因子VIII变体。可通过ELISA样测定来测量FVIII与vWF的结合，或使用表面等离振子共振测量为与固定化vWF的直接结合。在因子VIII中负责与vWF结合的区是如EP0319315中公开的跨越残基1670-1684的区。设想涉及该区域的因子VIII点突变体和/或缺失突变体将改变与vWF结合的能力。根据本专利技术，特别优选的点突变的实例包括含下述点突变的变体：Y1680F、Y1680R、Y1680N、Y1680C和E1682T。WO09156137公开了具有降低的vWF结合的融合蛋白，所述融合蛋白不与侧基(例如PEG)缀合。其中的蛋白关于各种比较测定似乎有用。因子VIII分子：FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的大的复杂糖蛋白。FVIII由2351个氨基酸(包含信号肽)组成，并包含若干个不同的结构域，如通过同源性所限定。有3个A-结构域、1个唯一的B-结构域和2个C-结构域。结构域顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。FVIII在血浆中以在B-A3边缘处分开的两条链循环。通过二价金属离子结合将链连接。A1-A2-B链命名为重链(HC)，而A3-C1-C2命名为轻链(LC)。内源性因子VIII分子体内以具有不同尺寸的B-结构域的分子库循环。可能是体内发生B结构域的逐渐酶促移除，产生具有不同尺寸的B-结构域的分子库。一般认为在位置740上切割(由此移除B-结构域的最后部分)与凝血酶活化一起发生。然而，不能排除其中例如在位置740上的切割位点已被损坏的因子VIII变体可能有活性。本文使用的“因子VIII”或“FVIII”指，为内在凝血途径的成员并对血液凝固必需的人血浆糖蛋白。“天然FVIII”是如在SEQIDNO:1(氨基酸1-2332)中所示的全长人FVIII分子。在SEQIDNO:1中B-结构域跨越氨基酸741-1648。SEQIDNO1：SEQIDNO2:SEQIDNO3:本专利技术的因子VIII分子可为B结构域截短的因子FVIII分子，其中残余结构域密切对应于如在SEQIDNO:1的氨基酸编号1-740和1649-2332中所示的序列，然而在残基1670-1684之间的vWF结合区内当然有一个或多个改变。然而，本专利技术的B结构域截短的分子可与如在SEQIDNO:1中所示的序列稍不同，意指残余结构域(即3个A结构域和2个C结构域)可与如在SEQIDNO:1(氨基酸1-740和1649-2332)中所示的氨基酸序列稍(例如约1%、2%、3%、4%或5%)不同，因为突变被导入以便降低vWF结合能力。此外，为了改变因子VIII与各种其他组分(例如LPR、各种受体、其他凝血因子、细胞表面、导入和/或废除的糖基化位点等)的结合能力，在分子的其他位置中导入氨基酸修饰(置换、缺失等)似乎可行。本专利技术的因子VIII分子具有因子VIII活性，意即在凝血级联中以功能上类似或等价于FVIII的方式起作用，通过在活化的血小板上与FIXa相互作用来诱导FXa形成，并支持血凝块形成的能力。通过本领域中公知的技术(例如凝块分析、内源性凝血酶潜能分析等)，可体外评估该活性。本专利技术的因子VIII分子具有的FVIII活性是天然人FVIII活性的至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和100%或甚至超过100%。融合蛋白：融合蛋白/嵌合蛋白是通过将两个以上最初编码单独蛋白的基因连接而产生的蛋白。该融合基因的翻译产生具有来源于各最初蛋白的功能性质的单一多肽。本专利技术的融合蛋白包含FVIII多肽和至少一种其他多肽。融合蛋白可任选包含至少一个接头。因此，FVIII多肽可不与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组因子VIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力，且其中所述分子与至少一种侧基共价缀合，该重组因子VIII分子是序列如SEQ ID NO：1所示的B‑结构域截短的因子VIII分子的变体，且该重组因子VIII分子包含Y1680R突变。

【技术特征摘要】
2010.02.16 EP 10153718.1;2010.02.18 US 61/3056081.一种重组因子VIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力，且其中所述分子与
至少一种侧基共价缀合，该重组因子VIII分子是序列如SEQIDNO：1所示的B-结构域截短
的因子VIII分子的变体，且该重组因子VIII分子包含Y1680R突变。
2.权利要求1的分子，其中所述侧基选自以下的一种或多种：亲水聚合物、白蛋白结合
剂、抗体或其片段和白蛋白。
3.权利要求1-2中任一项的分子，其中侧基与截短的B-结构域共价缀合，且其中因子
VIII活化导致共...

【专利技术属性】
技术研发人员：B佩施克，M科福德汉森，J布查特，HR施特尼克，H奥斯特加尔德，M克贾尔克，EHN奥尔森，JJ汉森，
申请(专利权)人：诺沃—诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK