本发明专利技术提供了一种来源于马克斯克鲁维酵母的高表达启动子KmINU1启动子、高效外泌的信号肽及其相应的表达系统及其表达系统。其中，具有SEQ ID No.2表示的核苷酸序列的KmINU1启动子具有最强的启动活性，且活性远远高于目前报道的KmPGK启动子。本发明专利技术的KmINU1启动子无需诱导即可启动下游基因的表达，并且目的基因能在宿主细胞生长稳定后高效表达，特别适合对宿主细胞生长有影响的外源基因的表达。本发明专利技术构建的含有KmINU1启动子和高效外泌的信号肽的表达系统适用于多种酵母菌，包括酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母等，为不同外源基因的高效表达奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因工程应用领域，具体涉及包含一种来源于马克斯克鲁维酵母的高表达启动子和外泌信号肽、包含该启动子和信号肽的重组载体、利用该载体在多种酵母中实现目的基因的高表达方法。
技术介绍
酵母细胞用于外源蛋白的分泌表达一直以来就被人们广泛关注。酵母细胞以其适于大规模生产、翻译后修饰系统较为完善以及无内毒素污染问题等优点而被研究人员广泛应用。但同样酵母细胞也具有表达量不高、信号肽加工不完全导致不能分泌大蛋白等缺点。目前，应用广泛同时也相对成熟的酵母表达系统包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、乳酸克鲁维酵母等。但是，传统的酵母表达体系在表达量和信号肽加工等方面还有待进一步完善。一些新型的非传统酵母，特别是马克斯克鲁维酵母，具有生长快、底物谱广泛、耐受高温等优势，受到了越来越多的关注，是极具开发前景的新型酵母表达系统和生物基化学品和生物能源的生产菌株(ApplMicrobiolBiotechnol,2008,79:339-354；FEMSYeastResearch,2015,15,1-13)。但截止目前，较为理想的启动子和信号肽研究较少，同时能够在其中自主复制并能够简单筛选的表达系统也相对匮乏，这些问题最终导致了马克斯克鲁维酵母至今无法广泛应用于各种蛋白的异源表达和基因工程改造。外源蛋白在宿主细胞内的异源表达的前提在于携带目的基因的载体能够在宿主细胞内进行自主的复制、转录和翻译过程，这一过程受制于不同宿主细胞内不同的复制起点。但是，与酿酒酵母和毕赤酵母相比，克鲁维属酵母作为宿主细胞的表达载体相对受限。真正使得克鲁维属酵母作为表达宿主而被人们关注是由于pKD1质粒的发现(Falconeetal.Plasmid,1986,15:248-252.)。含有pKD1质粒复制起点的表达载体能够保证其在酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母等中进行复制，并最终实现外源蛋白的表达。外源蛋白的表达量或者表达效率在很大程度上取决于选取的启动子的转录活性(PNAS，2005，102(36):12678-12683)。目前应用于克鲁维属表达系统的启动子分为三类：其自身启动子、来源于酿酒酵母启动子和非酵母启动子，如Tet-off，且多使用酿酒酵母的启动子(ApplMicrobiolBiotechnol，2013，97(5):2029-41)。而蛋白的胞外表达借助于外泌信号肽的介导，高效的信号肽同样能够帮助蛋白在胞外实现高表达量，并有利于进一步的蛋白分离纯化工作。
技术实现思路
本专利技术提供一种来源于马克斯克鲁维酵母的高表达启动子(KmINU1启动子)、高效外泌的信号肽及其相应的表达系统。本专利技术是采用如下技术方案来实现的：本专利技术的第一方面，提供一种高表达的启动子，其核苷酸序列为(a)～(d)中的任意一种：(a)如SEQIDNo.1表示的核苷酸序列；(b)如SEQIDNo.2表示的核苷酸序列；(c)截断上述(a)的核苷酸序列获得的核苷酸序列，其中截断获得的核苷酸序列包含上述(b)的核苷酸序列；(d)与上述(a)～(c)的核苷酸序列具有80％同源性并且在马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的核苷酸序列。上述高表达启动子命名为KmINU1启动子。本专利技术的第二方面，提供一种用于引导如上述所述的高表达启动子(KmINU1启动子)调控的外源蛋白分泌的信号肽，其特征在于，其核苷酸序列为(e)和(f)中的任意一种：(e)如SEQIDNo.3表示的核苷酸序列；(f)与上述(e)的核苷酸序列具有80％同源性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有外泌蛋白能力的核苷酸序列。本专利技术的第三方面，提供一种载体，其包含上述所述的高表达启动子(KmINU1启动子)所述的高表达启动子、上述所述的信号肽和能够在该高表达启动子的调控下工作的方式配置的外源蛋白基因。进一步地，所述载体含有在酵母中扩增的复制起点序列、筛选标记URA3基因和卡那霉素抗性基因，其中所述的复制起点序列如SEQIDNo.4。本专利技术上述所述的载体，带有在克鲁维酵母中扩增的复制起点，能够在克鲁维属酵母中实现目的基因的胞外高表达；且该载体带有URA3基因和卡那霉素抗性基因，具有简单筛选特性。本专利技术的第四方面，提供一种转化体，其通过将上述所述的载体导入酵母中而得到。进一步地，所述的酵母为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的任意一种。本专利技术的第五方面，提供一种外源蛋白基因的高表达方法，包括对上述所述的转化体进行培养的步骤。进一步地，上述所述的外源蛋白基因的高表达方法，还包括对培养得到的转化体中回收外源蛋白基因表达产物的步骤。与现有的克鲁维属的表达载体相比，本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术所述的KmINU1启动子具有较强的转录启动活性，不需要诱导物即可启动其下游基因的转录。并且该启动子在很大程度上解除了酵母中普遍存在的碳源阻遏效应，在相对较高的碳源浓度条件下能够保持较高的转录活性；(2)本专利技术所述的外源蛋白表达载体含有高效的菊粉酶信号肽，能够实现外源蛋白的胞外表达，为后续的分离纯化奠定基础；(3)本专利技术所述的外源蛋白表达载体含有卡那霉素的抗性基因，能够在酵母菌宿主内实现快速方便筛选；(4)本专利技术所述的表达载体的蛋白表达量随着时间逐渐积累，特别适合表达影响细胞生长的蛋白。附图说明图1是本专利技术提供的含有卡那抗性基因的载体pCXJ10-kan的结构示意图。图2是本专利技术提供的含有367bpKmINU1启动子和信号肽的胞外蛋白表达载体pCXJ10-kan-PS的结构示意图。图3是本专利技术提供的含有菊粉酶的表达载体pCXJ10-kan-inu的结构示意图。图4是不同截断长度的KmINU1启动子的启动活性比较。图5是367bpKmINU1启动子进一步截断的启动活性比较。图6是KmINU1启动子(如SEQIDNo.1所示)的结构与功能示意图。图7是以乳酸克鲁维酵母为宿主，绿色荧光蛋白为报告基因的KmINU1启动子和KmPGK启动子的活性比较。图8是在乳酸克鲁维酵母中，KmINU1启动子启动菊粉酶基因表达性能评价本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高表达的启动子，其核苷酸序列为(a)～(d)中的任意一种：(a)如SEQ ID No.1表示的核苷酸序列；(b)如SEQ ID No.2表示的核苷酸序列；(c)截断上述(a)的核苷酸序列获得的核苷酸序列，其中截断获得的核苷酸序列包含上述(b)的核苷酸序列；(d)与上述(a)～(c)的核苷酸序列具有80％同源性并且在马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种高表达的启动子，其核苷酸序列为(a)～(d)中的任意一种：
(a)如SEQIDNo.1表示的核苷酸序列；
(b)如SEQIDNo.2表示的核苷酸序列；
(c)截断上述(a)的核苷酸序列获得的核苷酸序列，其中截断获得的核苷
酸序列包含上述(b)的核苷酸序列；
(d)与上述(a)～(c)的核苷酸序列具有80％同源性并且在马克斯克鲁
维酵母(Kluyveromycesmarxianus)和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上
的酵母中具有启动子活性的核苷酸序列。
2.一种用于引导如权利要求1所述的高表达启动子调控的外源蛋白分泌的
信号肽，其特征在于，其核苷酸序列为(e)和(f)中的任意一种：
(e)如SEQIDNo.3表示的核苷酸序列；
(f)与上述(e)的核苷酸序列具有80％同源性并且在马克斯克鲁维酵母和
除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有外泌蛋白能力的核苷酸
序列。
3.一种载体，其包含权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁文杰，高教琪，李益民，白凤武，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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