猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术将猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的病毒液分别用二乙烯亚胺灭活，获得猪细小病毒抗原和猪伪狂犬病毒抗原，辅以油相佐剂制备成二联灭活疫苗。本发明专利技术二联灭活疫苗中两种抗原成分之间无免疫抑制，猪细小病毒抗原和猪伪狂犬病毒抗原按照体积比2:3制备的二联灭活疫苗在安全性和免疫保护效果上要优于各单苗的免疫效果，一针注射即对猪细小病毒病和猪伪狂犬病具有显著的免疫保护效果。本发明专利技术猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗的安全性更佳，避免了多次接种免疫出现的不良反应，降低了免疫成本，且使用方便，能够应用于有效预防猪细小病毒病和猪伪狂犬病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗，还涉及所述二联灭活疫苗的制备方法及其在预防猪细小病毒病和猪伪狂犬病中的应用，属于猪细小病毒病、猪伪狂犬病二联灭活疫苗的制备领域。
技术介绍
猪细小病毒(Porcineparvovims，PPV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvires，PRV)均很早就被证明能导致母猪繁殖障碍征。母猪被感染后，临床症状相似，均表现为流产、死胎、产木乃伊胎，母猪屡配不孕等。猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒呈世界性分布，给全球养猪业造成了巨大的、持续经济损失。中国于1983年首先在上海发现猪细小病毒感染，并进行了病毒的分离和鉴定，于1947年首次发现猪伪狂犬病，到目前为止已经感染中国大多数地区，是影响中国猪养殖业的两种重要疫病。猪细小病毒病、猪伪狂犬病目前尚无有效的药物治疗方法，进行疫苗接种是预防、控制甚至消灭猪细小病毒病、猪伪狂犬病最主要的措施之一。灭活疫苗由于其安全性高，不会引起散毒，也不会带来潜伏感染的问题，成为预防免疫的主要手段之一。目前中国市场上仅有猪细小病毒病、猪伪狂犬病的单苗，预防这两种疫病时需单独接种PPV和PRV单苗，免疫程序复杂、成本较高。随着养猪业向集约化方向的发展，防疫密度高，劳动强度大，联苗的研究和使用已成为一种必然趋势。因此，迫切需要开发一种免疫性高、安全性好、免疫程序简便的猪细小病毒与猪伪狂犬病毒二联灭活疫苗，特别是需要一种简单方便、工艺易于放大的二联灭活疫苗的制备方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗，该二联灭活疫苗能够应用于预防猪细小病毒病和猪伪狂犬病，不仅安全性好、免疫效果好，而且免疫程序简便；本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗的制备方法，该方法简单方便，工艺易于放大。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗，包括：水相和油相；其中所述水相包括猪细小病毒抗原和猪伪狂犬病毒抗原；按照体积比计，猪细小病毒抗原：猪伪狂犬病毒抗原＝1-5:1-5；优选的，按照体积比计，猪细小病毒抗原：猪伪狂犬病毒抗原＝1-3:1-3；最优选为2:3。本专利技术考察了猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗中猪细小病毒抗原和猪伪狂犬病毒抗原的不同比例。结果表明，猪细小病毒抗原：猪伪狂犬病毒抗原在5:1-2:3的范围内，免疫动物后的HI抗体效价、血清阳转数均高于PPV单苗或与PPV单苗相当；当PPV：PRV＝1:2-1:5的二联苗免疫后血清阳转数、HI抗体效价均低于PPV单苗，甚至PPV：PRV＝1:4-1:5的二联苗免疫后的HI抗体效价低于1:64，未能达到效检标准。其中只有猪细小病毒抗原：猪伪狂犬病毒抗原＝2:3时制备的二联灭活疫苗对PRV-JL株的攻毒保护率较PRV单苗(保护率为80％)或其它抗原比例(保护率为50％-85％)的效果显著好，保护率达到100％；而且免疫动物均无不良反应，安全性好；其它抗原比例的免疫组均出现不良反应，不良反应率在10％以上。因此，PPV：PRV＝2:3为本专利技术制备二联疫苗的最佳配比，而其他比例配制的二联苗与各单苗的免疫效果相比优势不显著，甚至未能达到效检标准。本专利技术所述猪细小病毒抗原的制备方法包括：培养猪细小病毒，收获病毒液，灭活、浓缩，即得。其中，所述培养猪细小病毒的细胞为ST细胞、PK-15细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)或猪肾原代细胞；优选为ST细胞；所述病毒液的病毒含量≥106.17TCID50/ml；所述灭活是向病毒液中加入二乙烯亚胺(BEI)溶液灭活；优选的，向病毒液中加入0.1mol/LBEI溶液，使BEI溶液的终浓度为4mM，32℃灭活48小时；所述浓缩为浓缩5倍；所述浓缩的方法为超滤法。本专利技术所述猪细小病毒为猪细小病毒(PPV)L株(中国专利CN101851609A)，其微生物保藏号是：CGMCCNo.3352；分类命名是：猪细小病毒；保藏时间是：2009年10月23日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术所述猪伪狂犬病毒抗原的制备方法包括：培养猪伪狂犬病毒，收获病毒液，灭活、浓缩，即得。其中，所述培养猪伪狂犬病毒的细胞为ST细胞、PK-15细胞、Marc-145细胞、MDBK细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)、兔肾传代细胞(RK)、鸡胚成纤维细胞或猪肾原代细胞；优选为ST细胞；所述病毒液的病毒含量≥108.0TCID50/ml；所述灭活是向病毒液中加入二乙烯亚胺(BEI)溶液灭活；优选的，向病毒液中加入0.1mol/LBEI溶液，使BEI溶液的终浓度为4mM，32℃灭活30小时；所述浓缩为浓缩5倍；所述浓缩的方法为超滤法。本专利技术所述猪伪狂犬病毒是猪伪狂犬病毒PRV-JL株(中国专利CN104388396A)，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.9903；分类命名是：猪伪狂犬病毒；保藏时间是：2014年10月28日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术所述猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗中，按照体积比计，水相：油相＝9:1。其中，所述油相选自艾菲金(美国辉瑞公司)、MontanideTMISA15AVG、MontanideTMISA206VG(法国赛比克公司)、矿物油、氢氧化铝胶、卡波姆、蜂胶中的任意一种或几种按照任意比例组成的组合物；优选为艾菲金。本专利技术进一步公开了一种所述猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)将猪细小病毒抗原与猪伪狂犬病毒抗原混合，制备水相；(2)将步骤(1)制备的水相与油相混合，乳化，即得。其中，步骤(1)所述制备水相还包括：向猪细小病毒抗原与猪伪狂犬病毒抗原的混合物中加入按体积比计终浓度不超过0.01％的硫柳汞和按体积比计终浓度不超过0.07％的10％(w/v，g/ml)EDTA，混合均匀。本专利技术所述猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗的安全性好，能够应用于预防猪细小病毒病或猪伪狂犬病中的任意一种或两种。效力检验结果表明，本专利技术猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗免本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪细小病毒病‑猪伪狂犬病二联灭活疫苗，包括：水相和油相；其中所述水相包括猪细小病毒抗原和猪伪狂犬病毒抗原；其特征在于：按照体积比计，猪细小病毒抗原：猪伪狂犬病毒抗原＝1‑5:1‑5。

【技术特征摘要】
1.猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗，包括：水相和油相；其
中所述水相包括猪细小病毒抗原和猪伪狂犬病毒抗原；其特征在于：按照
体积比计，猪细小病毒抗原：猪伪狂犬病毒抗原＝1-5:1-5。
2.按照权利要求1所述的猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗，
其特征在于：按照体积比计，猪细小病毒抗原：猪伪狂犬病毒抗原＝1-3:1-3；
优选为2:3。
3.按照权利要求1或2所述的猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫
苗，其特征在于，所述猪细小病毒抗原的制备方法包括：培养猪细小病毒，
收获病毒液，灭活、浓缩，即得。
4.按照权利要求3所述的猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗，
其特征在于，所述培养猪细小病毒的细胞为ST细胞、PK-15细胞、猪肾传
代细胞IBRS-2或猪肾原代细胞；优选为ST细胞；
所述病毒液的病毒含量≥106.17TCID50/ml；
所述灭活是向病毒液中加入二乙烯亚胺溶液灭活；优选的，向病毒液
中加入0.1mol/L二乙烯亚胺溶液，使二乙烯亚胺溶液的终浓度为4mM，
32℃灭活48小时；
所述浓缩为浓缩5倍；所述浓缩的方法为超滤法；
所述猪细小病毒的微生物保藏号是：CGMCCNo.3352。
5.按照权利要求1或2所述的猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫
苗，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒抗原的制备方法包括：培养猪伪狂犬
病毒，收获病毒液，灭活、浓缩，即得。
6.按照权利要求5所述的猪细小病毒病-猪伪狂犬病二联灭活疫苗，
其特征在于，所述培养猪伪狂犬病病毒的细胞为ST细胞、PK-15细胞、
Marc-145细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智明，关俊威，崔艳丽，王全杰，卢爱国，窦海艳，张凤强，丁国杰，陈欣，田野，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23