蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统及其制备方法和应用技术方案

一种蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统及其制备方法和应用，该基因载体系统是由阳离子类脂和助类脂蔗糖酯制备的脂质体与基因物质构成的复合物。其中阳离子类脂包括肽型阳离子类脂、双子型阳离子类脂和季铵盐型阳离子类脂；蔗糖酯包括蔗糖硬脂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖油酸酯和蔗糖芥酸酯。该载体能有效压缩质粒DNA和siRNA，在体外体内都能高效转染，并对细胞和小鼠几乎不产生毒性。本发明专利技术所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统在基因治疗中具有很好的研究和应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别是蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统及其制备方法。技术背景基因治疗（genetherapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。1990年美国国立卫生研究院采用基因治疗方法对腺苷脱氨酶缺陷症进行治疗，首次将基因治疗应用到临床并取得了成功。2000年采用基因治疗方法成功治疗联合免疫缺陷综合症，表明了基因治疗策略的有效性。基因治疗要得到进一步的发展，必须克服三个方面的难题：一、要有用于治疗的目的基因和接受目的基因的细胞；二、实现基因表达的可调控性；三、获得具有靶向性的高效的基因导入系统。其中，具有靶向性高效的基因导入系统，即基因载体成为制约基因治疗发展的关键因素。基因载体主要有两大类：病毒基因载体，非病毒基因载体。自从首次成功进行了基因治疗的临床试验以来，大部分采用转染效率高的病毒载体，但是病毒载体具有很高的免疫原性，易于与野生型病毒重组，载量有限、生产成本高且易被污染。1999年美国宾州大学以重组病毒为载体的基因治疗药物在临床试验中造成一名18岁受试者死亡。2000年法国内克尔医院在治疗重症联合免疫缺陷病的过程中应用逆转录病毒载体，在2003年发现有几名儿童产生了白血病。因此病毒载体的发展受到了限制。非病毒基因载体与病毒基因载体相比，虽然转染效率相对较低，但具有低免疫原性、低毒、外源基因整合率低，无基因插入片段大小限制、甚至可运载细胞核或染色体、使用简单，制备方便等优势。越来越多的研究人员开始选择非病毒载体进行基因治疗方面的研究。阳离子脂质体是目前研究最透彻、技术最成熟、应用最广泛的非病毒载体系统，具有类细胞结构和生物膜的特性，在体内可降解，可以保护其运载基因片段的生物活性。但其也存在一定的局限性，如细胞毒性大，对器官的靶向性不明显，基因转运机制不明确等，限制了阳离子脂质体的发展。因此，人们一直致力于对阳离子脂质体的各种构建及修饰，试图寻求一种高效低毒的基因治疗药物。蔗糖酯是一种非离子表面活性剂，由蔗糖和脂肪酸经酯化反应生成的单质或混合物。蔗糖酯具有广泛的亲水亲油平衡值（HLB），具有良好的分散、增溶性能。因此，蔗糖酯做为助类脂用于制备脂质体可以增强脂质体的分散性，增强脂质体与药物的配伍作用，加快药物释放速度、促进分散、防止结晶沉淀，并延长药物保质期限。另外，蔗糖酯生物相容性、生物降解性强，用于制备阳离子脂质体可降低脂质体的毒性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种细胞毒性小、在体外和体内基因转染效率高的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统及其制备方法及其应用，克服现有技术的不足。本专利技术的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统由蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体与基因物质组成，所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体由阳离子类脂和蔗糖脂肪酸酯构成。本专利技术的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其中所述蔗糖脂肪酸酯为单酯或双酯，其中单酯结构如下：，其中，R选自硬脂酸或月桂酸或油酸或棕榈酸或肉蔻酸或芥酸；所述的蔗糖脂肪酸酯的亲水亲油平衡值为：HLB<1或1≤HLB≤16。本专利技术的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其中所述阳离子类脂为肽型阳离子类脂，结构式为：；或双子型阳离子类脂，结构式为：；或季铵盐型阳离子类脂，结构式为：；其中：x选自1～6；y选自1～8；R选自C8-20烷基，该烷基包括直链烷基和支链烷基；AA选自精氨酸或组氨酸或天冬氨酸或丙氨酸或甘氨酸或鸟氨酸或赖氨酸；B选自Orn或Lys。本专利技术的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其中所述的阳离子类脂与蔗糖脂肪酸酯的质量比为1︰8～8︰1；所述蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体与基因物质的质量比为0.5︰1~32︰1。本专利技术的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其中所述的基因物质为质粒DNA或小干扰RNA。本专利技术的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统的制备方法，步骤如下：蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体的制备：（1）将阳离子类脂和蔗糖脂肪酸酯按照质量比1:8～8:1比例溶解于氯仿或甲醇中得溶液；（2）将（1）步骤得到的溶液在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥2～12h；（3）用乙醇或水或生理盐水或磷酸作为缓冲液或以乙醇、水、生理盐水、磷酸中的任意两种等质量的混合液进行水化，水化温度为10～80℃；水化时间为1～10h，超声震荡至澄清，得到蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体，浓度为0.5～3.0mg/mL；该蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体为分散在水相中形成的粒径大小为150～250nm的均一稳定的表面带有正电荷的阳离子脂质体；利用蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体与基因物质制备蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统：将蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体与质粒DNA或小干扰RNA，通过静电相互作用形成分散在水相中均一稳定的纳米颗粒，具体步骤如下：（1）取蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体分散在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混匀，使浓度为0.01μg/μL～0.64μg/μL；（2）将0.5～1.0μg质粒DNA或小干扰RNA稀释在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混匀，使质粒浓度为0.02μg/μL；（3）按照蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体与基因物质质量比0.5:1～32:1比例，将（1）和（2）两稀释液混匀，室温放置10~40min，即可得到蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统。本专利技术的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统的制备方法制备的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统在细胞转染中的应用及在体内转染中的应用，主要包括：1、所述蔗糖酯嵌入式阳离子脂质体基因载体可进入癌细胞中，完成目的基因在细胞内的转染。2、所述细胞为人宫颈癌细胞（Hela）和非小肺腺癌细胞（A549）。不同氮磷比下结合获得的所述蔗糖酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，在不同细胞内的转染效率会有所差异。3、所述蔗糖酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统可进入荷瘤小鼠癌细胞中，完成目的基因在细胞内的转染。4、本专利技术提供的蔗糖酯阳离子脂质体基因载体适用于编码荧光素酶、绿色荧光蛋白报告基因，也适用于其他各种实验所需的siRNA。该载体能高效运载pDNA和siRNA转染细胞。5、所述蔗糖酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统对细胞和小鼠几乎不产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其特征在于：所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统由蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体与基因物质组成，所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体由阳离子类脂和蔗糖脂肪酸酯构成。

【技术特征摘要】
1.一种蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其特征在于：所述的蔗糖脂
肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统由蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体与基因物
质组成，所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体由阳离子类脂和蔗糖脂肪酸酯构成。
2.根据权利要求1所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其特征在
于：所述蔗糖脂肪酸酯为单酯或双酯，其中单酯结构如下：
，
其中，R选自硬脂酸或月桂酸或油酸或棕榈酸或肉蔻酸或芥酸；
所述的蔗糖脂肪酸酯的亲水亲油平衡值为：HLB<1或1≤HLB≤16。
3.根据权利要求1或2所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其特征
在于：所述阳离子类脂为肽型阳离子类脂，结构式为：
；
或双子型阳离子类脂，结构式为：
；
或季铵盐型阳离子类脂，结构式为：
；
其中：x选自1～6；y选自1～8；R选自C8-20烷基，该烷基包括直链烷基和支链烷基；AA选
自精氨酸或组氨酸或天冬氨酸或丙氨酸或甘氨酸或鸟氨酸或赖氨酸；B选自Orn或Lys。
4.根据权利要求3所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其特征在
于：所述的阳离子类脂与蔗糖脂肪酸酯的质量比为1︰8～8︰1；所述蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳
离子脂质体与基因物质的质量比为0.5︰1~32︰1。
5.根据权利要求1或2或4所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其
特征在于：所述的基因物质为质粒DNA或小干扰RNA。
6.根据权利要求3所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其特征在
于：所述的基因物质为质粒DNA或小干扰RNA。
7.一种根据权利要求1所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统的制备
方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张树彪，赵轶男，崔诗慧，赫泽坤，徐宇虹，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21