桃PpeAMT1;1基因、转运蛋白、表达载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种桃PpeAMT1；1基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了上述桃PpeAMT1；1基因编码的转运蛋白、表达载体pYES2-PpeAMT1；1，以及表达载体pYES2-PpeAMT1；1的构建方法。本发明专利技术通过同源克隆方法从桃果实中克隆得到一个1515bp的片段，与其他作物的AMT1家族成员具有较高的同源性，氨基酸序列具有1个典型的ammonium transporter功能域，包括12个跨膜区，可推断其为一个新的桃铵转运体PpeAMT1；1基因。该基因在幼果形成及果实发育初期的表达水平最高，显著高于一年生叶、韧皮部、花和根部的表达水平，而在果实成熟时期的表达水平较低。该基因具有吸收外界NH4+的能力，推测其在桃果实发育初期NH4+的动态平衡中起重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及桃PpeAMT1；1基因、转运蛋白、表达载体及其构建方法，属于分子生物学和生物

技术介绍
铵离子(NH4+)是最主要的无机氮存在形式，是植物优先吸收的氮素营养，与植物的生长、发育和果实品质密切相关。铵肥在促进果实品质与产量等生理方面起重要作用，施用适量铵肥不仅可以显著地增强果实的内在品质，也可以改善了果实的外观品质。然而，相关报道主要集中在生理生化层面，有关果实品质、产量与NH4+的吸收、转运及其代谢的分子机理的报道鲜少。植物对NH4+的吸收是依赖定位于细胞质膜上的AMT转运体来实现完成的，分为AMT1和AMT2两个基因亚族。Ninnemann等从拟南芥中克隆并鉴定了第一个植物AMT1成员基因，迄今为止，关于该类基因结构与功能的报道主要集中在一年生草本植物拟南芥、番茄、百脉根、油菜和水稻等为研究材料。报道显示AMT1基因主要在一年生植物体的根部表现出高表达，主导根部NH4+的吸收(Preferentialexpressionofanammoniumtransporterandoftwoputativenitratetransportersinroothairsoftomato,LauterFR,NinnemannO,BucherM,RiesmeierJW,FrommerWB,Proc.Natl.Acad.Sci.USA；Threefunctionaltransportersforconstitutive,diurnallyregulated,andstarvation-induceduptakeofammoniumintoArabidopsisroots,GazzarriniS,LejayL,GojonA,NinnemannO,FrommerWB,PlantCell；Differentialregulationofthreefunctionalammoniumtransportergenesbynitrogeninroothairsandbylightinleavesoftomato,vonWirénN,LauterFR,NinnemannO,GillissenB,Walch-LiuP,EngelsC,JostW,FormmerWB,PlantJournal；FunctionalcharacterizationofanammoniumtransportergenefromLotusjaponicas,SalveminiF,MariniAM,RiccioA,PatriarcaEJ,ChiurazziM,Gene；Distinctexpressionandfunctionofthreeammoniumtransportergenes(OsAMT1；1–1；3)inrice,SonodaY,IkedaA,SaikiS,vonWirénN,YamayaT,YamaguchiJ,PlantCellPhysiol)，或主要在叶片表达，主导地上部的转运(FunctionalcharacterizationofanammoniumtransportergenefromLotusjaponicas,SalveminiF,MariniAM,RiccioA,PatriarcaEJ,ChiurazziM,Gene；Characterizationofthreefunctionalhigh-affinityammoniumtransportersinLotusjaponicuswithdifferentialtranscriptionalregulationandspatialexpression,D'ApuzzoE,RogatoA,Simon-RosinU,ElAlaouiH,BarbulovaA,BettiM,DimouM,KatinakisP,MarquezA,MariniAM,UdvardiMK,ChiurazziM,PlantPhysiology)。然而，植物AMT1家族基因成员的功能尚未完全清楚，AMT家族基因在果实发育及品质形成的具体功能及其调控机制更是未知的。由于木本植物具有多年生长的特性，具有与草本植物截然不同的氮素吸收转运特点，它们的AMT同源基因调控方式与生理功能亦有所差别，因此，从木本植物果实中分离并鉴定新的AMT同源基因具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术首次公开了从桃果实中分离出的铵转运体PpeAMT1；1基因的全长cDNA，并提供一种高效表达桃AMT基因的酵母表达载体构建方法。本专利技术公开了一种桃PpeAMT1；1基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还公开了上述桃PpeAMT1；1基因编码的转运蛋白，其序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术还公开了上述桃PpeAMT1；1基因表达载体pYES2-PpeAMT1；1，其特征在于载体为pYES2质粒，基因为SEQIDNO：1所示的基因。本专利技术还公开了上述桃PpeAMT1；1基因表达载体PpeAMT1；1的构建方法，其步骤包括：A、通过PCR方法扩增目的基因片段，并回收PCR产物，其中PpeAMT1；1基因5’端引物的碱基序列如SEQIDNO：3所示，PpeAMT1；1基因3’端引物的碱基序列如SEQIDNO：4所示；B、分别用KpnI和NotI双酶切PCR回收产物和pYES2质粒，然后用T4DNAligase连接，获得表达载体pYES2-PpeAMT1；1。本专利技术通过同源克隆方法从桃中克隆得到一个1515bp的片段，BLAST显示与其他作物的AMT1家族成员具有较高的同源性，氨基酸序列具有1个典型的ammoniumtransporter功能域，包括12个跨膜区，可推断其为一个新的桃铵转运体PpeAMT1；1基因。实时定量PCR结果表明，该基因在幼果形成及果实发育初期的表达水平最高，显著高于一年生叶、韧皮部、花和根部的表达水平，而在果实成熟时期的表达水平较低，推测其主要在果实发育过程中起作用。为了进一步了解AMT1；1基因功能，将其连接到酵母表达载体pYES2上，构建成重组质粒pYES2-PpeAMT1；1，并转化酵母菌31019b突变体(MATamepl△mep2△::LEU2mep3△::KanMX2ura3，由于缺失了吸收和转运NH4+的位点，在外界NH4+作为唯一氮源且浓度低于5mmolL-1时不能生长)。结果发现，该重组质粒能恢复酵母突变体的生长，表明PpeAMT1；1基因具有吸收外界NH4+的能力，为进一步探讨AMT1家族基因在桃果实发育中NH4+的吸收、转运和调控机制提供了方便和可能。附图说明图1为实施例1中桃、水稻、拟南芥、番茄和百脉根的AMT1；1蛋白氨基酸同源性比对图。图注：PpeAMT1；1：桃AMT1；1；OsAMT1；1：水稻AMT1；1；AtAMT1；1：拟南芥AMT1；1；LeAMT1；1：番茄AMT1；1；LjAMT1；1：百脉根AMT1；1；Consensus：氨基酸序列一致性。图2为实施例2中桃PpeAMT1；1基因在不同组织或器官的实时荧光定量RT-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桃PpeAMT1；1基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种桃PpeAMT1；1基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。
2.一种桃PpeAMT1；1转运蛋白，其序列如SEQIDNO：2所示。
3.一种桃PpeAMT1；1基因表达载体pYES2-PpeAMT1；1，其特征在于载体为pYES2
质粒，基因为SEQIDNO：1所示的基因。
4.一种桃PpeAMT1；1基因表达载体pYES2-PpeAMT1；1的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋志忠，张斌斌，马瑞娟，俞明亮，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32