本发明专利技术公开了一种用于俄罗斯天牛幼虫COI基因克隆的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。本发明专利技术还公开了一种用于俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒。本发明专利技术获得的一种用于俄罗斯天牛幼虫COI基因克隆的引物对，能够成功扩增出俄罗斯天牛幼虫COI基因的核苷酸序列，并优化了克隆条件和克隆体系制备了俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，灵敏度达5pg，可以快速准确鉴定俄罗斯天牛幼虫。因此该试剂盒可以作为快速鉴定俄罗斯天牛幼虫的有效工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及天牛科幼虫分类鉴定领域，具体涉及一种用于俄罗斯天牛幼虫克隆的引物对及其应用。
技术介绍
天牛幼虫的分类研究主要集中在个体形态学领域，但由于幼虫分离鉴定资料极其缺乏，许多种类的幼虫形态迄今尚未描述；不同地理分布的同种天牛幼虫，形态有一定差异；亲缘关系较近的种类，形态非常相似，鉴定时容易混淆。因此，随着分子生物学的发展，核酸序列分析（DNAsequenceanalysis)被越来越多地用于天牛幼虫的分子鉴定，在出入境检验检疫工作中具有重要意义。线粒体DNA(mtDNA)分子量较小，遵循母系遗传，进化速率快，是分子分类学重要的标记之一。其细胞色素氧化酶I、II(COI、COII)在近缘种及种下阶元的分类鉴定以及不同地理种群的遗传变异中应用较广。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是一种用于俄罗斯天牛幼虫克隆的引物对。本专利技术还要解决的技术问题是提供一种用于俄罗斯天牛幼虫克隆的鉴定试剂盒。技术方案：为实现上述目的，本专利技术的提供的一种用于俄罗斯天牛幼虫COI基因克隆的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。上游引物J173：5’-TAACAGCACATGCTTTTGTA-3’下游引物J1331：5’-GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3’；一种用于俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒，它包含上述的引物对。上述的用于俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒，于包括：1）预混剂A：由核苷酸序列如SEQIDNO：1的上游引物P110μL，核苷酸序列如SEQIDNO：1的下游引物P210μL，含有Mg2＋的10×PCRBuffer50μL，2.5mmol/L的dNTPs40μl，TaqDNA聚合酶4μl，ddH2O200μL组成；2）阴性对照：非俄罗斯天牛幼虫cDNA模板20μL；3）阳性对照：俄罗斯天牛幼虫cDNA模板20μL。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点如下：本专利技术获得的一种用于俄罗斯天牛幼虫COI基因克隆的引物对，能够成功扩增出俄罗斯天牛幼虫COI基因的核苷酸序列，并优化了克隆条件和克隆体系制备了俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，灵敏度达5pg，可以快速准确鉴定俄罗斯天牛幼虫。因此该试剂盒可以作为快速鉴定俄罗斯天牛幼虫的有效工具。附图说明图1：PCR方法特异性实验的电泳图。具体实施方式实施例1：试剂盒的制备。1、试验材料所用天牛标本均为江苏出入境检验检疫局各口岸昆虫实验室多年截获的标本。标本来源和采集时间见表1。此外，选取Genbank登录的28种天牛COI基因序列进行比对，见表2。表1实验标本名称和来源表2Genbank下载序列信息2、试剂含有Mg2＋的10×PCRBuffer，2.5mmol/L的dNTPs，TaqDNA聚合酶购自大连Takara公司；DNAMarker、GoldView购自南京上高生物公司；引物由上海金斯瑞有限公司合成。其它试剂均为进口或国产分析纯试剂。1、引物的设计与合成根据GenBank中28种天牛COI基因的全基因序列，使用引物设计软件Primer5.0设计两对特异性引物。本专利技术所要保护的引物对SEQIDNO：1和SEQIDNO：2为第一轮的引物对为上游引物J1718和下游引物N2191。第一轮：J173：5’-TAACAGCACATGCTTTTGTA-3’J1331：5’-GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3’；第二轮：J1718：5’-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3’N2191：5’-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3’；由上海金斯瑞有限公司合成，预期扩增片段大小约为481bp。阳性对照：俄罗斯天牛幼虫cDNA模板；阴性对照：非俄罗斯天牛幼虫cDNA模板。实施例2：鉴定方法按照以下步骤进行：（1）基因组总DNA提取：采用GenMag动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒：将酒精浸泡过的虫体，选择适当大小的肌肉组织，无菌水清洗2-3次，沥干水分后，将组织进行研磨，加入适量的裂解液和蛋白酶K，55℃温浴，使得组织完全裂解。再加入磁珠和缓冲液，使DNA吸附到磁珠上，使用WashBuffer进行除杂，除杂完毕后，加入少量的ElutionBuffer，将DNA溶解，得到基因组DNA溶液，-20℃保存。（3）PCR扩增：PCR反应体系采用50μl标准反应体系，其中含有10×PCRBuffer（Mg2＋）5μl，dNTPs（2.5mmol/L）4μl，TaqDNA聚合酶0.4μl，cDNA模板2μl，上下游引物各1μl，后加ddH2O补足50μl。PCR反应条件分别为：第一轮：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，循环结束后再72℃延伸10min。第二轮：94℃预变性3min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，循环结束后再72℃延伸10min。所得PCR产物，部分经1.5%琼脂糖电泳检测，溴化乙锭染色后紫外线下观察并拍照，剩余部分送上海金斯瑞有限公司纯化并测序。（4）PCR扩增产物分析：结束后取8μLPCR扩增产物加于1%琼脂糖凝胶孔中放于电压为100～130V的电泳槽里电泳45min，于紫外投射仪中观察结果，分别将俄罗斯天牛幼虫与其他天牛扩增结果进行电泳。从图1可以看出：俄罗斯天牛幼虫扩增出了一条481bp的片段，参见泳道1和泳道2，其他天牛均未扩增出片段，参见泳道3。实施例3：特异性实验用与实施例2相同的方法提取28种天牛的DNA，并以此为模板，用设计的引物进行PCR扩增。用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，只有俄罗斯天牛幼虫扩增出一条481bp的片段（见图1），将鸽细环阳性病料的PCR产物进行基因测序，与GenBank中已发表的序列进行比较，应用Mega5.0软件对天牛COI基因序列进行分析，发现在481个位点中保守位点90个，变异位点391个，信息位点375个，自裔位点16个，考虑到俄罗斯天牛幼虫不同物种间的高度差质性，可表明所扩增的片段为俄罗斯天牛幼虫的COI基因，而其他28种天牛均未扩增出片段均未扩增出条带来，这表明该方法所扩增的片段为俄罗斯天牛幼虫的COI基因片段。实施例4：稳定性实验将试剂保存于-20℃，经过一年的保存和反复冻融后，对俄罗斯天牛幼虫DNA模板重新进行检测，结果表明，该试剂盒的稳定性较好，可以长期保存。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出：对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利技术的保护范围。SEQUENCELISTING<110>申请人名称&l本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于俄罗斯天牛幼虫COI基因克隆的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
【技术特征摘要】
1.一种用于俄罗斯天牛幼虫COI基因克隆的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。
2.一种用于俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒，它包含权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的用于俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒，其特征在于包括：
预混剂A：由核苷酸序列如SEQIDNO：1的上游...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾忠盈，吕飞，
申请(专利权)人：中华人民共和国太仓出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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