一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒。它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1的组分及浓度如下：缓冲液I 10～100mmol/L；多聚阴离子化合物0.1～10mmol/L；二价阳离子0.1～100mmol/L；显色剂0.1～10mmol/L；表面活性剂I1～100g/L；表面活性剂II1～100g/L；防腐剂1g/L～50g/L；所述试剂R2的组分及浓度如下：缓冲液II10～100mmol/L；4‑氨基安替比林0.1～10mmol/L；表面活性剂Ⅲ1～100g/L；胆固醇酯酶0.1～10KU/L；胆固醇氧化酶0.1～10KU/L；过氧化物酶0.1～10KU/L；防腐剂1～50g/L。本发明专利技术在选择性抑制法的基础上进行改良，加入优选的复合表面活性剂对，在第一步反应中抑制并消除脂血干扰，因而脂血样本无需前处理，可以直接用于全自动生化分析仪检测，操作简便，提高了检测效率，降低了检测成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，属于高密度脂蛋白胆固醇测定领域。
技术介绍
人体血浆中胆固醇的存在和运输形式为血浆脂蛋白，即非极性的脂类包括胆固醇和亲水性的载脂蛋白结合。血浆脂蛋白按照密度不同主要可分为四种：高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)。其中高密度脂蛋白是由多种富蛋白质颗粒组成的，是一组不均一的脂蛋白，是密度最大的脂蛋白(d＝1.063～1.210kg/L)。其组分中蛋白质(Pro)、磷脂(PL)、胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)各约占50％、25％、20％和5％。HDL中蛋白质主要是载脂蛋白AI和AII；胆固醇占总胆固醇(TC)的25％～35％。临床研究表明，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)越低，发生冠状动脉粥样硬化的危险性就越大。HDL-C是冠心病辅助诊断的良好指标。HDL-C降低也多见于心、脑血管病，肝炎，肝硬化等患者。国外临床常规实验室直接分离测定HDL-C的方法大致分为2代。第1代为化学沉淀法，常用的沉淀剂为聚阴离子，如磷钨酸、DS、肝素或非离子多聚体如聚乙二醇(PEG)与某些两价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)合用。最早采用的是肝素-锰沉淀法(HM法)。后多采用DS50-Mg2+法，也有采用磷钨酸镁沉淀法(PTA-Mg2+法)和聚乙二醇沉淀法(PEG法)。具体原理是沉淀试剂可以选择性的聚集带正电荷的含有apoB的脂蛋白，HDL溶解在溶液中。用离心法分离出非HDL的凝集物，对上清液的胆固醇分析就可以测定HDL-C。化学沉淀法多受高TG影响，含apoB颗粒因不能完全沉淀而导致HDL-C假性增高。第2代为匀相测定法，均相法能够用于自动化分析仪不需要预处理，以化学和免疫学为基础，非HDL颗粒不需要沉淀，适当的振荡后，酶试剂会选择性解离血清样本中的胆固醇。标本用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面基本达到NCEP的分析目标，因此在短短的数年里迅速被临床实验室采用。目前应用的自动分析法有聚乙二醇修饰酶法、免疫分离法(IS)、选择性抑制法、消除法。聚乙二醇修饰酶法：用聚乙二醇(PEG)修饰改性胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，修饰酶对脂蛋白的结构具有选择性，其顺序依次为LDL<VLDL<CM<HDL；将a-环糊精进行硫酸化，Mg2+和葡聚糖(DS)共同作用能与非HDL形成沉淀，从而避免修饰酶对非HDL的作用，Mg2+和硫酸化环糊精能降低胆固醇的活性，特别是乳糜微粒和极低密度脂蛋白，因此不像沉淀法那样麻烦需要沉淀这些脂蛋白成分。故在Mg2+，DS，a-环糊精以及修饰酶作用下，可直接测定HDL-C。免疫分离法：第一步反应中含有apoB抗体，它与血清中的LDL、VLDL和CM亲和力强，共同作用形成抗原-抗体复合物；第二步反应时加入酶试剂，抗原-抗体复合物不发生酶联反应，HDL则被解离释放出胆固醇参与酶联反应，在显色剂的存在下发生显色反应，根据显色程度即可测定HDL-C含量。选择性抑制法：用一种表面活性剂和聚阴离子与富含apoB的脂蛋白形成聚合物，另一种特定的表面活性剂选择性地溶解HDL，解离出HDL-C在酶试剂中反应，直接测定HDL-C。解离的特异性是这种方法准确测定的一个关键，即含apoB的脂蛋白是否能在第一步反应中与多阴离子完全结合并被抑制剂“包裹\，而在第二步反应中不被打开。消除法：该方法主要是利用表面活性剂对HDL，LDL，VLDL和CM的选择性不同，在表面活性剂1的作用下，非HDL与表面活性剂l形成可溶性复合物，脂蛋白表面的游离胆固醇在胆固醇氧化酶(CHOD)的作用下发生反应氧化生成H202，过氧化物酶(POD)对H202作用从而将其清除。加入表面活性剂2选择性地解离HDL，在酶联试剂胆固醇酯酶(CHER)和胆固醇氧化酶作用下反应生成H202，过氧化物酶作用于H202在显色剂的存在下显色，根据吸光度大小测定HDL-C。与国外相比，国内的第l代为电泳法。第2代为化学沉淀法，1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA-Mg2+法作为HDL-C测定常规方法。第3代为匀相测定法。其中选择性抑制法在临床上应用广泛，此方法具有正确度好，精密度高，线性范围广等优点，但是在抗脂血干扰方面存在缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，所述试剂盒能够克服选择性抑制法现有技术存在的不抗脂血干扰缺陷。本专利技术所提供的检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1的组分及浓度如下：所述试剂R2的组分及浓度如下：所述的试剂盒中，所述缓冲液I的浓度均指的是其在所述试剂R1中的浓度，所述缓冲液II的浓度均指的是其在所述试剂R2中的浓度；所述缓冲液I和所述缓冲液II均可为2-吗啉乙磺酸(MES)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(Pipes)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(Hepes)中至少一种；所述缓冲液I和所述缓冲液II的pH均为6.0～7.0。所述的试剂盒中，所述多聚阴离子化合物可为环糊精硫酸盐、肝素硫酸盐、磷钨酸钠和硫酸葡聚糖中至少一种。所述的试剂盒中，所述二价阳离子可为Mg2+、Ca2+和Mn2+中至少一种。所述的试剂盒中，所述显色剂可为苯酚、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠(DHBS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺(TOOS)和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)中至少一种；所述防腐剂可为叠氮钠、庆大霉素和Proclin300中至少一种。所述的试剂盒中，所述表面活性剂I、所述表面活性剂II和所述表面活性剂Ⅲ均选自TritonX-100、Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、EmulgenA60(二苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚)、PEG-2000、PEG-6000、PEG-8000和胆酸盐中至少一种；所述表面活性剂I和所述表面活性剂II的HLB值之和大于13。HLB值指的是亲水亲油平衡值。所述的试剂盒中，所述胆固醇酯酶的1个酶活力单位指的是：在37℃、30℃，pH8.0条件下，每分钟水解1μmol胆固醇酯的酶活定义为1U；所述胆固醇氧化酶的1个酶活力单位指的是：在37℃、pH7.0条件下，每分钟生成1μmol过氧化氢的酶活定义为1U；所述过氧化物酶的1个酶活力单位指的是：在37℃、20℃，pH6.0条件下，pH8.0条件下，20s内生成1mg红紫棓精定义为1U。本专利技术试剂盒的组成具体如下：包括试剂R1和试剂R2，试剂R1的组成和浓度如下：MOPS的浓度指的是其在试剂R1中的浓度；试剂R2的组成和浓度如下：MOPS的浓度指的是其在试剂R2中的浓度。本专利技术还提供了一种高密度脂蛋白胆固醇含量的检测方法，包括如下步骤：将待测样品与所述的试剂盒组分混合，反应，检测，即得到所述待测样品中高密度脂蛋白胆固醇的含量；所述待测样品可为血清和血浆中的至少一种；所述检测采用吸收光谱法。利用本专利技术试剂盒进行检测的方法基于如下原理：第一反应中，多聚阴离子吸附到LDL、VLDL、CM上形成稳定的复合物，在脂蛋白颗粒表面形成遮蔽圈，同时在HDL表面也吸附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1的组分及浓度如下：所述试剂R2的组分及浓度如下：

【技术特征摘要】
1.一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1的组分及浓度如下：所述试剂R2的组分及浓度如下：2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液I和所述缓冲液II均为2-吗啉乙磺酸、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)、3-(N-吗啉代)丙磺酸和N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸中至少一种；所述缓冲液I和所述缓冲液II的pH均为6.0～7.0。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述多聚阴离子化合物为环糊精硫酸盐、肝素硫酸盐、磷钨酸钠和硫酸葡聚糖中至少一种。4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述二价阳离子为Mg2+、Ca2+和Mn2+中至少一种。5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述显色剂为苯酚、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：简娟，黄妍，
申请(专利权)人：北京世纪沃德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11