The invention relates to a recombinant eukaryotic protein specifically inhibits STAT3 activity and preparation method and application thereof, belonging to the field of medical and biological engineering, the specific length of STAT3 inhibitory activity of recombinant eukaryotic protein of 210 amino acids, of which 1 ~ 25 to 26 ~ 31 NLS sequence, His sequence, 34 ~ 199 MH2 200 ~ 210 sequence, TAT sequence, His sequence and MH2 sequence tags with KL two amino acids were connected by competitive binding principle; blocking ubiquitin mediated degradation of PIAS3 and promote the combination of PIAS3 and STAT3, to overcome the existing targeted inhibitors, RNA interference, antisense oligonucleotides and decoy oligonucleotide single signal from pathway analysis inhibit the activation of STAT3, but its efficacy and safety are difficult to achieve the anticipated problems, so as to effectively inhibit the proliferation of tumor cells, promote tumor stem cell sensitivity to chemotherapeutic drugs.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药生物工程领域,尤其涉及一种特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来肿瘤干细胞(tumorstemcells,TSCs)学说越来越受到关注。目前已经成功在脑肿瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中成功分离出了肿瘤干细胞。肿瘤干细胞假说认为,经药物治疗后肿瘤复发和转移与肿瘤干细胞残存有密切关系。肿瘤干细胞的提出为肿瘤发生和复发机制提供了合理解释,对于研发更有效的抗肿瘤药物及干细胞和细胞生物学研究均具有重大意义。信号转导与转录激活因子(SignalTransducerandActivatorofTranscription,STAT)蛋白家族是一组被细胞因子受体激活的相关蛋白,参与增殖、分化、凋亡以及免疫调节等重要的生物学进程。目前已知STATs家族有6个成员(STAT1-6),其中STAT3在多种恶性肿瘤中异常表达并持续活化,直接或间接调控多种癌基因从而影响肿瘤的发生和发展,并与肿瘤干细胞的维持和自我更新及放化疗抵抗关系密切。STAT3信号通路的激活途径主要有三类:经典的JAK-STAT3信号通路;受体依赖性酪氨酸激酶(RTKs)途径;非受体依赖性酪氨酸激酶(No-receptorRTKs)途径。当被上游信号激活并磷酸化后,STAT3聚合成同源或异源二聚体,进入胞核与靶基因启动子特定位点结合促进其转录。正常的STAT3激活是快速而短暂的,仅维持数分钟到几小时,但在多种肿瘤中存在STAT3持续性过度活化并诱导与细胞增殖、分化、凋亡密切相关的基因异常表达。研究发现许多致癌信号通路最终 ...
【技术保护点】
一种特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白,其特征在于,将能与PIAS3结合的转录因子Smad6的氨基端的166个氨基酸序列命名为MH2,在MH2的N端连接核定位肽NLS,在MH2的C端连接穿膜信号肽TAT,在NLS和MH2之间加入His标签,所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的功能区代号为:NLS‑His‑MH2‑TAT;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白全长210个氨基酸,其中1~25为NLS序列,26~31为His序列,34~199为MH2序列,200~210为TAT序列,所述His标签序列与所述MH2序列之间用KL两个氨基酸进行连接;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的氨基酸序列为:
【技术特征摘要】
1.一种特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白,其特征在于,将能与PIAS3结合的转录因子Smad6的氨基端的166个氨基酸序列命名为MH2,在MH2的N端连接核定位肽NLS,在MH2的C端连接穿膜信号肽TAT,在NLS和MH2之间加入His标签,所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的功能区代号为:NLS-His-MH2-TAT;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白全长210个氨基酸,其中1~25为NLS序列,26~31为His序列,34~199为MH2序列,200~210为TAT序列,所述His标签序列与所述MH2序列之间用KL两个氨基酸进行连接;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的氨基酸序列为:2.如权利要求1所述的特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白,其特征在于,所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白对应的碱基序列为:3.一种如权利要求1所述的特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的制备方法,其特征在于,包括:(1)NLS-His-MH2-TAT基因的克隆以pcDNA/Flag-Smad6载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含Smad6的166个氨基酸的MH2序列,在上下游引物中分别引入His序列和TAT序列,在N端引入NLS序列,得到初级PCR产物,以所述初级PCR产物为模板扩增最终的NLS-His-MH2-TAT序列,而后在最终的NLS-His-MH2-TAT序列两端分别引入内切酶HindIII和KpnI酶切位点,得到PCR产物;用所述内切酶HindIII和KpnI酶切所述PCR产物,再用胶回收试剂盒回收,得到PCR酶切产物;用所述内切酶HindIII和KpnI酶切所述PCR产物,经1%琼脂糖凝胶电泳后用质粒抽提试剂盒回收,得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒;在温度为3~5℃的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质粒连接过夜,而后转化至E.coliDh5α感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上,在温度为36~38℃的环境下培养过夜;挑取单菌落,LB液体培养基过夜培养后通过PCR初筛阳性克隆、质粒抽提试剂盒抽提,得到阳性质粒:pcDNA3.1-NLS-His-MH2-TAT;(2)HEK293细胞的转染与表达将pcDNA3.1-NLS-His-MH2-TAT通过脂质体转染试剂转染HEK293细胞48小时后,加入新霉素进行加压筛选,构建表达NLS-Hi...
【专利技术属性】
技术研发人员:邹健,焦建同,邵君飞,李正,丁小鹏,张锐,殷莹,蒋孟军,
申请(专利权)人:无锡市人民医院,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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