特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白及其制备方法和应用技术

技术编号:14594379 阅读:171 留言:0更新日期:2017-02-08 23:23
本发明专利技术涉及一种特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白及其制备方法和应用,属于医药生物工程领域,该特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白全长210个氨基酸,其中1~25为NLS序列,26~31为His序列,34~199为MH2序列,200~210为TAT序列,His标签序列与MH2序列之间用KL两个氨基酸进行连接;通过竞争性结合原理阻断PIAS3的泛素化降解并促进PIAS3与STAT3的结合,克服了现有的靶向抑制剂、RNA干扰、反义寡核苷酸和诱饵寡核苷酸等单从信号通路角度抑制STAT3活化,但是其效果和安全性都难以达到预期的问题,从而有效抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性。

Eukaryotic recombinant protein with specific inhibition of STAT3 activity, preparation method and application thereof

The invention relates to a recombinant eukaryotic protein specifically inhibits STAT3 activity and preparation method and application thereof, belonging to the field of medical and biological engineering, the specific length of STAT3 inhibitory activity of recombinant eukaryotic protein of 210 amino acids, of which 1 ~ 25 to 26 ~ 31 NLS sequence, His sequence, 34 ~ 199 MH2 200 ~ 210 sequence, TAT sequence, His sequence and MH2 sequence tags with KL two amino acids were connected by competitive binding principle; blocking ubiquitin mediated degradation of PIAS3 and promote the combination of PIAS3 and STAT3, to overcome the existing targeted inhibitors, RNA interference, antisense oligonucleotides and decoy oligonucleotide single signal from pathway analysis inhibit the activation of STAT3, but its efficacy and safety are difficult to achieve the anticipated problems, so as to effectively inhibit the proliferation of tumor cells, promote tumor stem cell sensitivity to chemotherapeutic drugs.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物工程领域,尤其涉及一种特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白及其制备方法和应用
技术介绍
近年来肿瘤干细胞(tumorstemcells,TSCs)学说越来越受到关注。目前已经成功在脑肿瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中成功分离出了肿瘤干细胞。肿瘤干细胞假说认为,经药物治疗后肿瘤复发和转移与肿瘤干细胞残存有密切关系。肿瘤干细胞的提出为肿瘤发生和复发机制提供了合理解释,对于研发更有效的抗肿瘤药物及干细胞和细胞生物学研究均具有重大意义。信号转导与转录激活因子(SignalTransducerandActivatorofTranscription,STAT)蛋白家族是一组被细胞因子受体激活的相关蛋白,参与增殖、分化、凋亡以及免疫调节等重要的生物学进程。目前已知STATs家族有6个成员(STAT1-6),其中STAT3在多种恶性肿瘤中异常表达并持续活化,直接或间接调控多种癌基因从而影响肿瘤的发生和发展,并与肿瘤干细胞的维持和自我更新及放化疗抵抗关系密切。STAT3信号通路的激活途径主要有三类:经典的JAK-STAT3信号通路;受体依赖性酪氨酸激酶(RTKs)途径;非受体依赖性酪氨酸激酶(No-receptorRTKs)途径。当被上游信号激活并磷酸化后,STAT3聚合成同源或异源二聚体,进入胞核与靶基因启动子特定位点结合促进其转录。正常的STAT3激活是快速而短暂的,仅维持数分钟到几小时,但在多种肿瘤中存在STAT3持续性过度活化并诱导与细胞增殖、分化、凋亡密切相关的基因异常表达。研究发现许多致癌信号通路最终都集中在一套核转录因子上,靶向单一的转录因子即可阻断一群上游基因变化引起的持续激活,转录因子是抑癌的理想靶点;STAT3是肿瘤多个关键信号通路及基因调控中的“关节点”,因此STAT3已成为癌症治疗上最有希望的靶点之一。然而,肿瘤中STAT3多呈非配体(EGF、IL-6等)依赖的组成性激活。现有靶向抑制剂、RNA干扰、反义寡核苷酸和诱饵寡核苷酸等单从信号通路角度抑制STAT3活化,其效果和安全性都难以达到预期,因此从内源性调节机制入手研究如何抑制STAT3在肿瘤中的异常转录调控活性日益受到重视。STAT3通路中重要的内源性负性调控因子——活化STAT3蛋白抑制子3(ProteininhibitorofactivatedStat3,PIAS3)是特异的细胞核内STAT3抑制蛋白,它能与STAT3结合并阻断后者与DNA结合进而抑制靶基因的表达,因而在STAT3的信号通路和转录调控活性上发挥“分子闸门”的作用。PIAS3的活性对于维持正常的生理和组织稳态至关重要,它通过对STAT3在内的多种癌基因或转录因子活性的抑制,从而发挥抑癌作用。研究发现,当PIAS3沉默后,STAT3活性持续增高,肿瘤细胞增殖活性显著提高;而PIAS3上调则可抑制肿瘤的生长并增强对化疗药物的敏感性。PIAS3与EGFR抑制剂联合能产生协同抗肿瘤作用。这些都提示PIAS3具有抑癌基因活性,其在肿瘤中的作用也正日益受到重视。而且,PIAS3在多种恶性肿瘤中低表达并与肿瘤细胞增殖失控和患者不良预后有关,因此在肿瘤细胞中抑制PIAS3降解有利于维持其对肿瘤中STAT3活性的抑制,从而达到抑制肿瘤的目的。Smad6属于Smad蛋白家族中的抑制型Smads之一。近年研究发现Smad6不但对BMP和TGFβ信号通路有抑制作用,而且对Wnt/β-catenin、TLR4及IL-1R/Toll样受体、糖皮质激素受体信号通路也有调控作用。因此,Smad6参与了多种信号通路及核蛋白间的相互作用,使其在肿瘤中的作用日益受到关注,Smad6对转录因子的抑制作用往往通过蛋白相互作用并启动泛素蛋白酶系统促进其泛素化降解。Smad6C-端结构域介导了Smad6与多种蛋白的结合,且是Smad6诱导结合蛋白泛素化降解不可或缺的功能域。我们研究发现Smad6在胶质瘤中的促癌功能可能与其促进PIAS3的泛素化降解从而促进STAT3异常活化有关。进一步对Smad6蛋白结构域研究显示C端MH2功能域介导了SMAD6与与PIAS3的结合,并且是促进PIAS3泛素化降解不可或缺的要素。而单独构建MH2的表达载体可阻断SMAD6与PIAS3的结合并促进后者(PIAS3)的稳定性从而抑制肿瘤细胞中STAT3的活性。更重要的是MH2载体在体内实验中显示了其显著的抑制肿瘤效应。因而,以Smad6MH2为核心,利用穿膜肽为引导的真核重组蛋白,可特异的靶向抑制STAT3活性并显示更有效的肿瘤抑制作用,具有更高的实用价值。
技术实现思路
针对上述存在的问题,本专利技术提供一种特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白及其制备方法和应用,以克服现有的靶向抑制剂、RNA干扰、反义寡核苷酸和诱饵寡核苷酸等单从信号通路角度抑制STAT3活化,但是其效果和安全性都难以达到预期的问题,通过竞争性结合原理阻断PIAS3的泛素化降解并促进PIAS3与STAT3的结合,从而有效抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性。为了实现上述目的,本专利技术采取的技术方案为:一种特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白,其中,将能与PIAS3结合的转录因子Smad6的氨基端的166个氨基酸序列命名为MH2,在MH2的N端连接核定位肽NLS,在MH2的C端连接穿膜信号肽TAT,在NLS和MH2之间加入His标签,所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的功能区代号为:NLS-His-MH2-TAT;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白全长210个氨基酸,其中1~25为NLS序列,26~31为His序列,34~199为MH2序列,200~210为TAT序列,所述His标签序列与所述MH2序列之间用KL两个氨基酸进行连接;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的氨基酸序列为:上述的特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白,其中,所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白对应的碱基序列为:上述的特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的制备方法,其中,包括:(1)NLS-His-MH2-TAT基因的克隆以pcDNA/Flag-Smad6载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含Smad6的166个氨基酸的MH2序列,在上下游引物中分别引入His序列和TAT序列,在N端引入NLS序列,得到初级PCR产物,以所述初级PCR产物为模板扩增最终的NLS-His-MH2-TAT序列,而后在最终的NLS-His-MH2-TAT序列两端分别引入内切酶HindIII和KpnI酶切位点,得到PCR产物;用所述内切酶HindIII和KpnI酶切所述PCR产物,再用胶回收试剂盒回收,得到PCR酶切产物;用所述内切酶HindIII和KpnI酶切所述PCR产物,经1%琼脂糖凝胶电泳后用质粒抽提试剂盒回收,得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒;在温度为3~5℃的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质粒连接过夜,而后转化至E.coliDh5α感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上,在温度为36~38℃的环境下培养过夜;挑取单菌本文档来自技高网
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特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白及其制备方法和应用

【技术保护点】
一种特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白,其特征在于,将能与PIAS3结合的转录因子Smad6的氨基端的166个氨基酸序列命名为MH2,在MH2的N端连接核定位肽NLS,在MH2的C端连接穿膜信号肽TAT,在NLS和MH2之间加入His标签,所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的功能区代号为:NLS‑His‑MH2‑TAT;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白全长210个氨基酸,其中1~25为NLS序列,26~31为His序列,34~199为MH2序列,200~210为TAT序列,所述His标签序列与所述MH2序列之间用KL两个氨基酸进行连接;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的氨基酸序列为:

【技术特征摘要】
1.一种特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白,其特征在于,将能与PIAS3结合的转录因子Smad6的氨基端的166个氨基酸序列命名为MH2,在MH2的N端连接核定位肽NLS,在MH2的C端连接穿膜信号肽TAT,在NLS和MH2之间加入His标签,所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的功能区代号为:NLS-His-MH2-TAT;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白全长210个氨基酸,其中1~25为NLS序列,26~31为His序列,34~199为MH2序列,200~210为TAT序列,所述His标签序列与所述MH2序列之间用KL两个氨基酸进行连接;所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的氨基酸序列为:2.如权利要求1所述的特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白,其特征在于,所述特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白对应的碱基序列为:3.一种如权利要求1所述的特异性抑制STAT3活性的真核重组蛋白的制备方法,其特征在于,包括:(1)NLS-His-MH2-TAT基因的克隆以pcDNA/Flag-Smad6载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含Smad6的166个氨基酸的MH2序列,在上下游引物中分别引入His序列和TAT序列,在N端引入NLS序列,得到初级PCR产物,以所述初级PCR产物为模板扩增最终的NLS-His-MH2-TAT序列,而后在最终的NLS-His-MH2-TAT序列两端分别引入内切酶HindIII和KpnI酶切位点,得到PCR产物;用所述内切酶HindIII和KpnI酶切所述PCR产物,再用胶回收试剂盒回收,得到PCR酶切产物;用所述内切酶HindIII和KpnI酶切所述PCR产物,经1%琼脂糖凝胶电泳后用质粒抽提试剂盒回收,得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒;在温度为3~5℃的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质粒连接过夜,而后转化至E.coliDh5α感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上,在温度为36~38℃的环境下培养过夜;挑取单菌落,LB液体培养基过夜培养后通过PCR初筛阳性克隆、质粒抽提试剂盒抽提,得到阳性质粒:pcDNA3.1-NLS-His-MH2-TAT;(2)HEK293细胞的转染与表达将pcDNA3.1-NLS-His-MH2-TAT通过脂质体转染试剂转染HEK293细胞48小时后,加入新霉素进行加压筛选,构建表达NLS-Hi...

【专利技术属性】
技术研发人员:邹健焦建同邵君飞李正丁小鹏张锐殷莹蒋孟军
申请(专利权)人:无锡市人民医院
类型:发明
国别省市:江苏;32

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