本发明专利技术公开了一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基，包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为8CF，其中8为A‑83‑01、C为CHIR99021、F为毛喉素。本发明专利技术诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为神经细胞，所得神经细胞具有正常神经细胞特异性分子标签，并且具有正常神经细胞的功能，为再生医学的细胞来源问题提供一种新的途径。
Induction medium for inducing fibroblasts to differentiate into nerve cells and application thereof
The invention discloses a method for inducing fibroblast to differentiate into neural cells induced by the medium, including basic medium and small molecule induced by combination, the combination of 8CF induced by small molecules, of which 8 were A 01, C 83 for CHIR99021, F for forskolin. The invention of induction medium can be fibroblast induced to differentiate into neural cells, the neural cells have normal nerve cell specific molecular label, and with normal neural cells, and provide a new way for cell source for regenerative medicine.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基及其应用。
技术介绍
多细胞生物体绝大部分是由全能性的受精卵发育而来的。精卵结合形成的受精卵经历逐级谱系分化最终发育为成熟个体。其中，细胞的命运决定是成千上万的外源信号与内源因子协同作用的结果，这一过程复杂而难以操控。近些年生命科学飞速发展，其中最引人注目的成就之一便是人们通过外源途径来改变细胞的命运。通过过量表达谱系特异性调控因子，人们不仅能使成体细胞去分化为胚胎干细胞，还能实现不同世系成体细胞之间的转分化过程。随着重编程技术的发展以及干细胞本身所具有的特性，使得人类有可能在体外培养某些干细胞，诱导其分化或定向转分化为具有重要功能的体细胞，以供临床所需；同时，再生医学则正是利用组织工程、干细胞移植和药物等临床手段，将功能无法自行恢复的病变组织、器官得到结构和功能的重建。干细胞在治疗神经和神经损伤举得一些疗效，但依然面临着细胞来源不足的问题，且异体移植又可能会导致免疫排斥的发生。目前，通过在体细胞中强制表达特定重编程因子，介导体细胞直接转分化为某些珍贵的或者不可再生的细胞，为解决上述细胞来源不足的问题提供了新的途径。然而，外源基因过量表达的方法技术壁垒较高，表达载体可能插入基因组，导入系统安全性存在隐患，效率也有待提高。除了特异性基因的诱导手段，一些小分子化合物也被证实能够促进细胞重编程过程，且重编程过程中的所有转录因子都可以被小分子所替代。小分子化合物不仅具有渗透入细胞膜、易操控和成本低等优势，并且小分子能实现没有任何外源基因介入的体细胞重编程过程，这无疑为人们获得多能性干细胞提供了新的方法和思路。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用添加有小分子组合的诱导培养基诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的方法。在系统分析了10多种小分子的不同组合对小鼠成纤维细胞基因表达和克隆形态影响的基础上，发现小鼠成纤维细胞可以同时转变为包括神经细胞、心肌细胞和脂肪细胞等各种体细胞类型。这种随机多向转分化的现象，称之为小分子组合诱导的多向转分化(inducedmulti-lineagetrans-differentiation，iMT)。具有这种功能的小分子组合称为诱导小分子组合。一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基，包含基础培养基和诱导小分子组合，诱导小分子组合为8CF，其中8为A-83-01、C为CHIR99021、F为毛喉素(Forskolin，FSK)。其中，A-83-01是TGF-β信号通路中ALK5位点的抑制剂；CHIR99021是GSK3抑制剂；毛喉素是腺苷酸环化酶的激活剂。所述基础培养基可以为常用的细胞培养基，比如DMEM培养基添加5％～15％的胎牛血清。因为本专利技术使用的成纤维细胞直接取自小鼠，属于细胞的原代培养，细胞相对比较脆弱，所以还可以适当添加些谷氨酰胺、bFGF和β-巯基乙醇等促进细胞生长的营养物质，一般添加的浓度为谷氨酰胺1～3mM、bFGF30～50ng/mL、β-巯基乙醇0.005～0.02mM。当然，为了防止细菌污染，在基础培养基中还可以添加一些抗生素，比如链霉素、青霉素等，一般添加浓度为链霉素50～200μg/mL和青霉素50～200U/mL。优选的，所述诱导小分子组合中各组分的浓度为：80.1～1μMC8～12μMF8～12μM。最优选的，所述诱导小分子组合中各组分的浓度为：80.5μMC10μMF10μM。诱导小分子组合中各组分的浓度是在参考了各种文献报道的基础上，再经实验验证得到的，浓度过低或过高都会造成诱导转分化的效果变差。本专利技术又提供了一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的方法，使用所述的诱导培养基对成纤维细胞进行培养。优选的，所述的成纤维细胞来源于小鼠。所述的成纤维细胞来源于10.5～14.5天的小鼠胚胎。或者，所述的成纤维细胞来源于小鼠尾尖。优选的，所述成纤维细胞培养的第2天起开始使用所述的诱导培养基进行培养，每4天更换一次培养基。然后统计克隆数，观察细胞形态，并提取总RNA进行RT-qPCR，检测相关基因的表达情况，从而初步确定诱导转分化成功，然后将转分化所得的神经细胞进行电生理和流式细胞术等检测。本专利技术还提供了利用所述方法获得的神经细胞。本专利技术还提供了所述的神经细胞在药物筛选中的应用。如用于治疗神经方面疾病的药物筛选。本专利技术诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为神经细胞，所得神经细胞具有正常神经细胞特异性分子标签，并且具有正常神经细胞的功能，为再生医学的细胞来源问题提供一种新的途径。附图说明图1为诱导小分子组合功能性筛选流程图；图2为不同小分子组合产生克隆个数与上调基因的散点图；图3为实施例2中不同iMT类型细胞的验证结果图；其中神经细胞(a-Actinin)、肝细胞(AFP)、脂肪细胞(Cebpa)、表皮细胞(E-cadherin)、神经细胞(Tuj1、GFAP)、平滑肌细胞(SMA)的免疫荧光染色，内脏层器官细胞的PAS染色和脂肪细胞的油红染色，图4为实例3中6TCF小分子组合处理TTF的免疫荧光图；其中图A为6TCF组合处理后抗a-Actinin的免疫荧光图和对应的细胞核图片；图B为6TCF组合处理后抗Tuj1的免疫荧光图和对应的细胞核图片；图5为实施例4中诱导所得神经细胞的检测结果图；其中，图A为诱导所得细胞的明场图；B为诱导所得细胞的荧光图；C为诱导前成纤维细胞的流式检测图；D为诱导后细胞的流式检测图；图6为实施例5中所得神经细胞的验证结果图；其中，A为电生理实验示意图；图B为利用电压钳检测神经细胞的Na+与K+电流结果图；图7为实施例5所得神经细胞相关特异性基因转录水平检测结果图，其中图A和图B分别为不同基因的mRNA水平检测结果；图8为实施例5所得神经细胞免疫荧光结果图。具体实施方式基础培养基：DMEM、15％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、40ng/mLbFGF、0.01mMβ-巯基乙醇、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。诱导培养基为在基础培养基的基础上添加0.5μMA-83-01、10μMCHIR99021和10μM毛喉素。实施例1(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的制备步骤如下：1)培养器皿的预处理：以0.2％明胶覆盖培养皿的底壁，室温下放置30min后，将0.2％明胶吸出，室温下备用。2)给孕13.5天的小鼠(野生型小鼠或携带GFAP-GFP报告系统的转基因小鼠)注射约0.5mL阿佛丁麻醉后，实施断颈法处死小鼠，将其浸入75％酒精中消毒5分钟。3)用75％乙醇擦拭腹部，剪开皮肤并把皮肤向后拉，暴露出腹壁。剪开腹壁以暴露出子宫。将子宫移到100mm的皿里，用10mLPBS洗三遍。4)用剪刀剪开胚囊，并将胚胎移到培养皿中。5)小心去除胚胎的头和内脏，将胚胎躯干部分转移到青霉素小瓶中，用2mLPBS洗三遍。6)用眼科剪将组织剪碎，加入2mL的0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA，将悬液移入50mL离心管中，并在37℃孵育大约20min，每隔5min振荡几下。7)充分吹打后加入10mL培养基终止消化，静置5min后，将上层约8mL的细胞悬液移入培养皿中，置37℃，5％CO2培养6h后，换液。8)细胞约90％汇合时传代。(2)小鼠尾尖成纤维细本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基，包含基础培养基和诱导小分子组合，其特征在于，所述诱导小分子组合为8CF，其中8为A‑83‑01、C为CHIR99021、F为毛喉素。
【技术特征摘要】
1.一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基，包含基础培养基和诱导小分子组合，其特征在于，所述诱导小分子组合为8CF，其中8为A-83-01、C为CHIR99021、F为毛喉素。2.如权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述诱导小分子组合中各组分的浓度为：80.1～1μMC8～12μMF8～12μM。3.一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的方法，其特征在于，使用如权利要求1或2任一所述的诱导培养基对成纤维细胞进行培养。4.如权利要求3...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭国骥，李侠，韩晓平，岑燕红，张芬，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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