本发明专利技术公开了一种用于过表达乳酸脱氢酶C的CHO细胞的培养方法,通过在其培养基中直接加入LDH-C酶促反应底物,如乳酸钠、丙酮酸钠等,模拟高浓度乳酸状态的培养环境,最终达到了过表达LDH-C重组细胞培养过程中乳酸生成量,提高细胞存活率和抗凋亡能力的效果。
Culture method for over expressing lactic dehydrogenase C animal cell
The invention discloses a method for culturing the expression of lactate dehydrogenase C CHO cells in the culture medium, by directly adding the substrate of LDH-C, such as sodium lactate, sodium pyruvate, culture environment simulation of high lactic acid concentration, eventually reaching the overexpression of recombinant LDH-C cell culture in the process of lactic acid production, to improve cell survival and anti apoptosis ability effect.
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术属于生物
,更具体的公开了一种用于过表达乳酸脱氢酶C(lactatedehydrogenaseC)动物细胞的培养方法。
技术介绍
:在过去几十年间,以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为代表的动物细胞被广泛用于重组蛋白的表达(Jayapal,KP.etal.,(2007)ChemEngProg103:40-43)。重组蛋白的表达量取决于积分活细胞密度和单个细胞单位时间的表达量(Wurm,FM.(2004)NatBiotechnol22:1393-1398)。在发酵过程中,有很多参数影响积分活细胞密度,比如乳酸(Lao,MS.etal.,(1997)BiotechnolProg13:688-691)和氨(Hansen,HA.etal.,(1994)BiotechnolProg10:121-124)等代谢废物。乳酸经由糖酵解途径产生,它是由乳酸脱氢酶转化丙酮酸而来。乳酸的毒性源于其本身,以及为中和乳酸所添加的碱,这些碱的添加同时提高了渗透压(Cruz,H.etal.,(2000)EnzymeMicrobTechnol27:43-52)。乳酸的累积损伤细胞生长,也会引起产物表达量的降低。为了减少乳酸带来的副作用,人们采取了各种措施降低乳酸浓度。培养基或培养过程优化是降低乳酸的两种措施,这些方法往往促使细胞消耗乳酸(GagnonM.etal.,(2011)BiotechnolBioeng108:1328-1337).然而,这些方法往往受限于特定的细胞系,当更换细胞系后,这些配方和培养过程也需要随之改变。基因工程改造是降低乳酸毒副作用的另外一种有前途的方法。这些方法包括:通过过表达GLUT5转运子使用乳糖作为主要碳源(WlaschinKF.etal.,(2007)JBiotechnol131:168-176)、过表达Bcl-2∆加速丙酮酸进入到三羧酸循环(TempletonN.etal.,(2014)MetabEng25:92-102)、转运子GLUT1RNA干扰降低葡萄糖消耗速率(ParedesC.etal.,(1999)Cytotechnology30:85-93)、过表达苹果酸脱氢酶II增加NADH的消耗(ChongWPK.etal.,(2010)JBiotechnol147:116-121)、过表达丙酮酸羧化酶改善进入到三羧酸循环的碳流量(KimS.etal.,(2007)ApplMicrobiolBiotechnol76:659-665)以及乳酸脱氢酶RNA干扰阻止乳酸生成(KimS.etal.,(2007)ApplMicrobiolBiotechnol74:152-159)。除此之外,人们联合两个或更多基因以更大程度上降低乳酸。比如:联合使用乳酸脱氢酶A敲除和bcl-2过表达(JeonM.etal.,(2011)ApplMicrobiolBiotechnol92:779-790)、丙氨酸氨基转移酶和牛磺酸转运子过表达(TabuchiH.etal.,(2013)BiotechnolBioeng110:2208-15)。这些努力在一定程度上减缓了乳酸的累积,然而,在补料分批培养中乳酸最终仍然会累积到足以损伤细胞的浓度。乳酸脱氢酶在体内能够可逆的催化丙酮酸与乳酸之间的转化。乳酸脱氢酶存在LDH-A,LDH-B,LDH-C三种亚基。由不同亚基构成的乳酸脱氢酶亚型具有不同的催化能力。LDH-C亚型主要表达于生殖细胞中,由其构成的LDH-5亚型可以将乳酸转化丙酮酸进入三羧酸循环。中华仓鼠卵巢细胞(CHO)和杂交瘤细胞SP2/0细胞主要表达LDH-A亚型。SP2/0细胞中LDH-A的含量为5800,LDH-B亚型的含量仅为28,不表达LDH-C亚型。而在CHO细胞中主要表达LDH-A亚型的表达量是LDH-C的50倍,不表达LDH-B亚型(WO2012075124)。WO2012075124公开一种过表达LDH-C的重组细胞系构建方法,可降低发酵过程中乳酸生成,提高SP2/0细胞存活率的的方法,但是,其对于过表达LDH-C的重组细胞系未进行培养工艺,尤其是培养基组分的优化。丙酮酸、乳酸作为三羧酸循环中的重要代谢产物,同时也是LDH-C酶促反应的主要底物。本专利技术通过在LDH-C过表达重组细胞的培养基中加入LDH-C酶促反应底物(乳酸钠、丙酮酸钠等),最终达到提高LDH-C过表达重组细胞的乳酸消耗量,提高重组细胞存活率、抗凋亡能力的效果。
技术实现思路
:在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的培养中,乳酸是一种常见的代谢副产物,当它累积到一定程度之后抑制细胞生长、降低重组蛋白表达量。为了降低乳酸,人们采用了很多基因工程方法,然而到了补料分批培养末期,乳酸仍然累积到足以损伤细胞的浓度。本专利技术针对过表达LDH-C的CHO细胞,通过在培养基中添加酶促反应底物(丙酮酸钠、乳酸钠),模拟细胞高浓度乳酸的培养环境,最终达到了降低培养过程乳酸生成量,提高细胞存活率和抗凋亡能力的效果。本专利技术公开了:1、一种用于过表达乳酸脱氢酶C的CHO细胞的培养方法,其特征在于,培养基中加入LDH-C酶促反应底物。2、上述一种用于过表达乳酸脱氢酶C的CHO细胞的培养方法,其特征在于,所述LDH-C酶促反应底物,含有丙酮酸钠0-60mM,优选为40mM。3、上述一种用于过表达乳酸脱氢酶C的CHO细胞的培养方法,其特征在于,所述LDH-C酶促反应底物,含有乳酸钠0-60mM,优选为40mM。上述添加LDH-C酶促反应底物的培养方法应用,该培养方法的应用可以降低过表达乳酸脱氢酶C的CHO细胞培养过程中乳酸的生成,延长过表达LDH-C的CHO细胞培养周期、提高其抗凋亡能力。总之,本专利技术针对过表达LDH-C的CHO细胞,通过在其培养基中直接加入LDH-C酶促反应底物,如乳酸钠、丙酮酸钠等,模拟高浓度乳酸状态的培养环境,最终达到了过表达LDH-C重组细胞培养过程中乳酸生成量,提高细胞存活率和抗凋亡能力的效果。进一步提高了过表达LDH-C重组细胞在实际生产中的应用价值。附图说明图1、不同克隆乳酸脱氢酶mRNA含量图2、不同克隆的细胞生长情况图3、重组克隆LDH-C#6的LDH-C酶活图4、过表达LDH-C对细胞密度的影响图5、过表达对LDH-C细胞活性的影响图6、过表达LDH-C对乳酸生成的影响图7、不同浓度乳酸钠对LDH-C#6细胞密度的影响图8、不同浓度乳酸钠对LDH-C#6细胞活性的影响图9、40mM乳酸钠对LDH-C#6细胞密度的影响图10、40mM乳酸钠对LDH-C#6细胞活性的影响图11、40mM乳酸钠对LDH-C#6细胞乳酸积累的影响图12、不同浓度丙酮酸钠对LDH-C#6细胞密度的影响图13、不同浓度丙酮酸钠对LDH-C#6细胞活性的影响图14、40mM丙酮酸钠对LDH-C#6细胞密度的影响图15、40mM丙酮酸钠对LDH-C#6细胞活性的影响图16、40mM丙酮酸钠对LDH-C#6乳酸积累的影响图17、40mM丙酮酸钠对LDH-C#6细胞早期凋亡的影响图18、40mM丙酮酸钠对LDH-C#6细胞晚期凋亡的影响图19、40mM丙酮酸钠对LDH-C#6细胞凋亡率的影响。具体实施方式以下实施例、实验例进一步详细地描述本专利技术。然而应当理解本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于过表达乳酸脱氢酶C的CHO细胞的培养方法,其特征在于,培养基中加入LDH‑C酶促反应底物。
【技术特征摘要】
1.一种用于过表达乳酸脱氢酶C的CHO细胞的培养方法,其特征在于,培养基中加入LDH-C酶促反应底物。2.根据权利要求1所述,一种用于过表达乳酸脱氢酶C的CHO细胞的培养方法,其特征在于,所...
【专利技术属性】
技术研发人员:钱卫珠,
申请(专利权)人:上海张江生物技术有限公司,
类型:发明
国别省市:上海;31
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