尿液中HIV相关蛋白的检测制造技术

公开了检测哺乳动物中HIV感染的方法。该方法包括从哺乳动物的尿液样品中分离外泌体和检测所述分离的外泌体中HIV特异性生物标志物的存在的步骤。还公开了诊断患有HIV相关疾病、特别是患有HIV相关肾病的哺乳动物的方法。

Detection of HIV related proteins in urine

Methods for detecting HIV infection in mammals are disclosed. The method comprises the steps of separating an exocrine from a mammalian urine sample and detecting the presence of a HIV specific biomarker in the isolated exocrine. Also disclosed are methods for the diagnosis of HIV related diseases, especially in mammals with HIV associated nephropathy.

【技术实现步骤摘要】
本申请要求2009年10月2日提交的美国专利申请流水第12/572,652号的优先权，该美国专利申请要求2008年10月6日提交的美国临时申请流水第61/102,941号的优先权。通过引用将所有上述申请的全文并入本文。专利
本专利技术通常涉及诊断方法，并且具体而言，涉及使用尿液中的生物标志物来检测HIV感染、诊断HIV或HIV相关疾病的方法。
技术介绍
通常对血清或血浆进行HIV测试。HIV抗体的检测是HIV-1感染的推定证据，并且通常通过Western印迹方法进行验证。通过p24抗原测定进行的病毒检测或通过RT-PCR进行的病毒RNA检测也用于确定循环中病毒的量。CD4/CD8T细胞比和其他免疫功能测试也常用于监测免疫状态和向AIDS的进展。最近，还开发了使用唾液或口腔中上皮细胞的HIV测试。然而，目前没有可用的检测尿液中抗原或抗体的测试。尿液中HIV蛋白的检测可以提供检测HIV感染或疾病进展，特别是肾脏并发症的更快速的方法。HIV相关肾病(HIVAN)是尤其困扰非洲人种的肾病，其特征为肾脏肥大和快速进展以及阶段性肾病。HIVAN是由HIV-1病毒直接感染肾脏细胞所引起并且通过病毒基因产物而导致肾脏损伤。HIVAN也能够由HIV感染期间细胞因子释放的改变所引起。HIVAN的病因学仍然未知。据估算，90％的HIVAN患者是非洲人种，这表明该疾病具有遗传倾向(Wyatt,CM.,Klotman,P.E.HIV-AssociatedNephropathyintheEraofAntiretroviralTherapy(逆转录病毒疗法时代的HIV相关肾病).AmericanJournalofMedicineReview2007)。当患者的肾脏活组织切片检查表现出局灶性节段性肾小球硬化，伴随肾小管扩张和炎症、微囊型肾小管、退变的肾小球毛细血管，并联合明显的蛋白尿时，可诊断为HIVAN(同上)。然而，该方法是创伤性操作并且因为会造成创伤有时会被患者拒绝。因此，需要对于HIV或HIV相关疾病的可靠、快速、合算和较低创伤性的诊断测试。专利技术概述本专利技术一方面涉及检测哺乳动物中HIV感染的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：从所述哺乳动物的尿液样品中分离外泌体，以及检测来自所述分离的外泌体的HIV相关生物标志物。在相关实施方案中，该方法还包括以下步骤：根据所述分离的外泌体中HIV相关生物标志物是否存在来确定该哺乳动物是否被HIV感染。在相关的实施方案中，通过离心分离外泌体。在另一相关的实施方案中，通过过滤分离外泌体。在另一相关实施方案中，通过一种或多种选自以下的技术检测外泌体：电泳、Western印迹、HPLC、FPLC、MS和蛋白质测序。在另一相关实施方案中，通过SELDI-TOF-MS和LC-MS/MS检测外泌体。在另一相关实施方案中，HIV相关生物标志物选自Nef、HIV包膜gp120、HIV蛋白酶、Vif、Gag-Pol、Gag、p24、Rev、逆转录酶(RT)、Tat、p1、p17、Vpu、Vpr、gp41和DNA聚合酶。在另一相关实施方案中，HIV相关生物标志物是Nef、HIV蛋白酶、Vif、Pol或Gag。在另一相关实施方案中，HIV相关生物标志物是Nef。在一个相关实施方案中，哺乳动物是人、猴、大猩猩或狒狒。在另一相关实施方案中，哺乳动物是人。本专利技术的另一方面涉及诊断哺乳动物中HIV相关疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：从所述哺乳动物的尿液样品中分离外泌体，以及检测来自所述分离的外泌体的HIV相关生物标志物。在另一相关实施方案中，所述HIV相关疾病是HIV相关肾病。在另一相关实施方案中，该方法还包括以下步骤：根据所述分离的外泌体中所述HIV相关生物标志物是否存在来确定该哺乳动物是否患有HIV相关肾病。在一个相关实施方案中，哺乳动物是人、猴、大猩猩或狒狒。在另一相关实施方案中，哺乳动物是人。本专利技术的另一方面涉及监测哺乳动物中HIV感染进展的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：从所述哺乳动物的尿液样品中分离外泌体，以及检测来自所述分离的外泌体的所述HIV相关生物标志物。在另一相关实施方案中，该方法还包括以下步骤：根据所述分离的外泌体中所述HIV相关生物标志物是否存在来确定所述哺乳动物中HIV感染进展。本专利技术的另一方面涉及监测哺乳动物中HIV相关肾病进展的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：从所述哺乳动物的尿液样品中分离外泌体，以及检测来自所述分离的外泌体的所述HIV相关生物标志物。在另一相关实施方案中，该方法还包括以下步骤：根据所述分离的外泌体中所述HIV相关生物标志物是否存在来确定所述哺乳动物中HIV相关肾病进展。本专利技术的另一方面涉及监测用抗HIV药剂治疗哺乳动物的功效的方法。该方法包括下述步骤：在给予药剂之前，测定获自哺乳动物的尿液样品中的尿液外泌体中HIV相关生物标志物谱；测定所述哺乳动物的一个或多个给药后的尿液样品中的尿液外泌体中HIV相关生物标志物谱；将给药前样品中HIV相关生物标志物谱与给药后样品中HIV相关生物标志物谱进行比较；以及确定所述药剂的功效。在相关实施方案中，该方法还包括以下步骤：改变所述药剂对所述哺乳动物的给药。本专利技术的另一方面涉及用于检测哺乳动物中HIV感染或监测哺乳动物中HIV感染进展的试剂盒。所述试剂盒包含用于制备检测用外泌体样品的一种或多种试剂和至少一种作为标准的HIV相关生物标志物。在另一相关的实施方案中，通过Western印迹检测外泌体。在另一相关实施方案中，试剂盒还包含标签。在另一相关实施方案中，试剂盒还包含带有说明书的标签。本专利技术的另一方面涉及用于诊断哺乳动物中HIV相关疾病或监测哺乳动物中HIV相关疾病进展的试剂盒。所述试剂盒包含用于制备检测用外泌体样品的一种或多种试剂和至少一种作为标准的HIV相关生物标志物。在另一相关实施方案中，所述HIV相关疾病是HIV相关肾病。在一个相关实施方案中，HIV相关生物标志物选自Nef、HIV包膜gp120、HIV蛋白酶、Vif、Gag-Pol、Gag、p24、Rev、逆转录酶(RT)、Tat、p1、p17、Vpu、Vpr、gp41和DNA聚合酶。在另一相关实施方案中，HIV相关生物标志物是Nef、HIV蛋白酶、Vif、Pol或Gag。在另一相关实施方案中，HIV相关生物标志物是Nef。附图简要说明图1是流程图，其示出了使用来自哺乳动物的尿液样品检测哺乳动物中HIV感染或监测哺乳动物中HIV感染进展的方法的实施方案。图2A-2C是来自HIVAN组中患者的尿液外泌体的样品SELDI-TOF-MS谱的组图。图3A-3D是来自AAHIV+组中患者的尿液外泌体的样品SELDI-TOF-MS谱的组图。图4A-4C是来自HIV白种人组中患者的尿液外泌体的样品SELDI-TOF-MS谱的组图。图5A-5E是来自FSGS组中患者的尿液外泌体的样品SELDI-TOF-MS谱的组图。图6A-6C是来自正常对照组中患者的尿液外泌体的样品SELDI-TOF-MS谱的组图。图7A-7E是分离自HIVAN组(图A)、FSGS组(图B)、非裔美国人(AA)HIV+组(图C)、白种人HIV+组(图D)和正常对本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过检测外泌体中的HIV相关生物标志物来检测哺乳动物中HIV感染或监测哺乳动物中HIV感染进展的试剂盒，包含：用于制备检测用外泌体的一种或多种试剂，其中所述外泌体分离自所述哺乳动物的尿液样品；和至少一种标准品，其中所述标准品是HIV相关生物标志物。

【技术特征摘要】
2008.10.06 US 61/102,941;2009.10.02 US 12/572,6521.通过检测外泌体中的HIV相关生物标志物来检测哺乳动物中HIV感染或监测哺乳动物中HIV感染进展的试剂盒，包含：用于制备检测用外泌体的一种或多种试剂，其中所述外泌体分离自所述哺乳动物的尿液样品；和至少一种标准品，其中所述标准品是HIV相关生物标志物。2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述HIV相关生物标志物选自Nef、HIV包膜gp120、HIV蛋白酶、Vif、Gag-Pol、Gag、p24、Rev、逆转录酶、Tat、p1、p17、Vpu、Vpr、gp41和DNA聚合酶。3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述HIV相关生物标志物是Nef、HIV蛋白酶、Vif、Pol或Gag。4.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述HIV相关生物标志物是Nef。5.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述哺乳动物是人、猴、大猩猩或狒狒。6.如权利要求5所述的试剂盒，其中所述哺乳动物是人。7.如权利要求1所述的试剂盒，还包含用于通过一种或多种选自以下的技术来检测所述外泌体样品中HIV相关生物标志物的一种或多种试剂：电泳、Western印迹、HPLC、FPLC、质谱和蛋白质测序。8.如权利要求1所述的试剂盒，还包含用于通过Western印迹来检测所述外泌体样品中HIV相关生物标志物的一种或多种试剂。9.如权利要求1所述的试剂盒，还包含用于通过SELDI-TOF-MS或LC-MS/MS来检测所述外泌体样品中HIV相关生物标志物的一种或多种试剂。10.如权利要求1所述的试剂盒，还包含用于从尿液样品中分离外泌体的离心滤器。11.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述离心滤器的分子量截留值为约500kd至约50kd。12.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述离心滤器的分子量截留值为约100kd。13.如权利要求1所述的试剂盒，还包含标签、说明书或二者。14.如权利要求1所述的试剂盒，还包含外泌体重悬溶液。15.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述重悬溶液包含缓冲剂或蛋白酶。16.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述分离为离心分离。17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述离心分离为将所述尿液样品以100,000g或更高速离心15-120分钟。18.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述离心分离为将所述尿液样品以100,000g离心30-90分钟。19.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述离心分离为将所述尿液样品以100,000g离心60分钟。20.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述离心分离为将所述尿液样品以5,000-25,000g离心5-30分钟，将上清转移至另一管，将转移的上清以100,000g离心15-120分钟。21.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述离心分离为将所述尿液样品以20,000-22,000g离心15分钟，将上清转移至另一管，将转移的上清以...

【专利技术属性】
技术研发人员：加乐·W·纽曼，麦克·鲍威尔，阿金斯·多赫蒂，张伯伦·奥拜罗，克劳德特·米切尔阿里，卡里德·巴舍尔，马福斯·坎，
申请(专利权)人：莫尔豪斯医学院，
类型：发明
国别省市：美国;US